质粒克隆

质粒克隆，转化及抽提操作流程

一 载体酶切:载体切2-5 µg vector

1.在微量离心管中配制下列反应液, 全量定容至100 μl

DNA sample 3-5μg

10× Buffer 10 μl

Enzyme A 2 μl

Enzyme B 2 μl

H2O up to 100 μl

37℃或酶的最适温度, 120分钟,

2. Alkaline Phosphatase的去磷酸反应

直接在从中促反应液中加

10×Alkaline Phosphatase Buffer 12 μl

CIAP（10～30 U/μl） 1 μl

dH2O 7 μl

Total 120μl

37℃ 反应 60分钟。

三 纯化： 苯酚法

a) 加dH2O至350μl（目的是减少纯化损失）

b) 加 350μl苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提1次。 仔细取上清，不要吸下层和中间蛋白质层。取大约330μl

c) 加330 （要与3.2以的量相等）氯仿/异戊醇（24：1）抽提1次。 取300μl上清。（可能损耗15%）

d 添加 30 μl的3 M NaOAC（10分之一体积）。

e 添加 750 μl的（2.5倍量）冷95%乙醇，在-20℃下保冷30分钟。

f 12000转，4℃离心,15 min，回收沉淀，

g 用500 μl的 70％冷乙醇（用95%制备）洗一次，12000转，4℃离心, 5 min

h. 弃上清，反扣管口在清互的滤纸上吸净残余的上清，空气干燥10-15分钟。

I. 用水或TE Buffer溶解沉淀z。具体如下

2μg 20μl

3μg 25 μl

4μg 30 μl

5μg 35 μl

3.8 测OD,并在1%AGAROSE 电泳检测。

Note: 浓度需大于50ng/μl

二．连接

以下反应均在冰上操作。

在微量离心管中配制下列反应液, 全量定容至10 μl

酶切载体 100 ng

待连接片断 30-100 ng (载体摩尔数的1-3倍)

2× T4 RAPID ligase buffer 5 μl

T4 ligase (3U/μl) 1 μl

H2O up to 10 μl

22℃ 连接 1小时，或是过夜

三．转化:

1. 连接产物5μl, 加100 μl 感受态细胞DH5α,

NOTE：如是质粒直接转化，通常只需要1 ng,，感受态细胞20 μl

2. 混均置冰上, 30 min,

3. 42度,热激60秒, 置冰上2 min 以上,

4. 加入900 μl SOC培养液, 37度,180 RPM , 1 小时

5. 取100 μl 直接涂布于LB+ 50 ug/ml kan 的平板上

6. 6000 RPM 离心 , 3 分钟, 弃上清,

NOTE：若是质粒直接转化，无需离心，只需取5 μl-10μl 直接铺板

7. 加100 μl SOC 培养液, 混均, 每块平板取100 ΜL 涂布于LB+ 抗生素的平板上,

8. 37 度, 12-18 小时,

NOTE： 在使用AMP+时，时间长，可能会出现卫星克隆。

四．鉴定:

1. 取5-10个单菌落, 分别加入20μl水中，

2. PCR鉴定: TOTAL 20 μl

Above sample 2 μl

10X PCR buffer 2 μl

25 mM Mg2+ 2 μl

10 mM dNTP 0.4 μl

Primer R 5 pmol/μl 1 μl

Primer R 5 pmol/μl 1 μl

Tag 酶（5U/μl） 0.1 μl

dH2O 11.5 μl

94℃ 5 min

94℃ 30 s , 58℃ 30s，72℃ 1 min 35cycles；

72℃ 7 min ; 4℃ 1 min

1. agarose , 电泳检测。

3. 取PCR鉴定阳性的克隆3个， 4 ml LB +抗生素, 250 RPM, 37 度, 16-18小时

4. 只抽其中的一个质粒,酶切鉴定相符后，送测序。