搏饲ＣＥＲＥ ＡＬ＆ＦＥＥＤ科工ＩＮＤＵＳＴ ＲＹ ２０１２，Ｎｏ．８ 饲斟资源开发及应用■ 酶解及二次发酵豆粕生产富肽蛋白的研究 黄思敏，刘 军，张锦盛，孙东伟 （四川理工学院生物工程学院，四川Ｉ自贡６４３０００） 摘 要：利用黑曲霉和米曲霉混菌一次固态发酵所得豆粕，通过酶解及二次发酵生产富肽产品，研究酶解及二次 发酵条件对生产富肽蛋白的影响。结果表明，一次发酵豆粕补３倍水磨浆、接种１ 乳酸茵、活性干酵母１：１混合 菌种，木瓜蛋白酶０．３％，３７℃发酵１２ ｈ，再５５℃酶解３６ ｈ所得富肽蛋白小肽质量分数达到７５．４Ｏ 。 关键词：豆粕；酶解；二次发酵；富肽蛋白；氮溶指数 中图分类号：￥８１６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００３—６２０２（２０１２）００８—００４３—０４ Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ Ｈｕａｎｇ Ｓｉｍｉｎ，Ｌｉｕ Ｊｕｎ，Ｚｈａｎｇ Ｊｉｎｓｈｅｎｇ，Ｓｕｎ Ｄｏｎｇｗｅｉ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｉｇｏｎｇ ６４３０００，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｕｓｉｎｇ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ｂｙ ｓｏｌｉｄ—ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｉｘｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｎｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ，ｐｅｐｔｉｄｅ－ ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｒｉｃｈ ｐｒｏ＇ｔｅｉｆｌ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ：ｗａｔｅｒ ｉｎ ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｄｄｅｄ ｔｈｒｅｅ ｔｉｍｅｓ ｔｈｅ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ｆｏｒ ｐｒｉｍａｒｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ６ｎ，ｉｎｏｃｕ— ｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ １ ｍｉｘｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ（１ａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ。ａｃｔｉｖｅ ｄｒｙ ｙｅａｓｔ—ｌ：１），ｔｈｅｎ ａｄｄｉｎｇ ｐａｐａｉｎ ０．３ ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｔ ３７℃ｆｏｒ １２ ｈ，ａｎｄ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ａｔ ５５℃ｆｏｒ ３６ ｈ，ｔｈｅ ｒｉｃｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ７５．４０ ． ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ；ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ；ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｐｅｐｔｉｄｅ—ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘ 豆粕是一种优质的植物蛋白，具有蛋白质含量 产品的口感、风味等感官指标。在动物饲养试验中 高、氨基酸组分合理的优点，但由于大豆蛋白质分子 也表明，饲料中添加富肽蛋白，更易于动物的消化利 结构复杂、相对分子量大、消化率和生物学效价低， 用，且增强豆粕饲料的诱食性，从而提高动物的生产 直接作为动物饲料时，幼畜难以消化，且成年动物的 性能 。 蛋白质利用率低口］。 随着饲料工业迅速发展，我国饲用蛋白源尤其 １材料与方法 是动物蛋白源日渐缺乏，成为了饲料工业及畜牧水 １．１试验材料 产业发展的制约因素。常用的动物蛋白源鱼粉，因 豆粕由自贡福星饲料有限公司提供。 其必需氨基酸含量高、结构合理、适口性好、易消化 黑曲霉、米曲霉、乳酸菌由本实验室保藏。活性 利用等优点，成为配制仔猪全价日粮的常规蛋白质 干酵母为市售。 饲料原料＿２ ］。但由于技术相对落后及资源有限，我 三氯乙酸、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、 国高品质鱼粉主要依赖高价进口。相对于鱼粉，豆 硼酸、盐酸为分析纯，市售。 粕作为饲用蛋白源的价格优势十分明显。在国外， 电子分析天平、电热恒温水浴锅、ｐＨ计、凯氏 很早以前研究学者从小肽营养理论和吸收机制以及 定氮仪２２００型。 在动物饲料生产中的应用等方面做了较深入的研 １．２检测方法 究，相继研制出很多肽制品。在国内，我国从２０世 １．２．１粗蛋白含量测定 纪９Ｏ年代开始酶解肽的研究，大豆低聚肽的开发与 利用凯式定氮仪２２００型，采用微量定氮法，测 应用等酶解肽项目被列入国家重点科技攻关项目。 定样品中粗蛋白质的质量分数。 研究证明，利用微生物发酵法，可将豆粕蛋白转化为 测定步骤： 小分子肽，提高豆粕的营养价值。同时，添加适量的 （１）消化：精确称取ｍ ｇ样品，干净无损地转入 酵母菌和乳酸菌到酶解液中进行二次发酵，可提高 消化管中，加入加速剂３～５ ｇ，再加入浓硫酸５ ｍｌ。 收稿日期：２０１２－０５—２６；修回日期：２０１２－０６—２５ 作者简介：黄思敏（１９８７一），女，硕士研究生，研究方向为微生物代谢调控。 通讯作者：刘军（１９６４一），男，教授，研究方向为微生物发酵与代谢调控。 ■ 黄思敏等：酶解及二次发酵豆粕生产富肽蛋白的研究／２ｏ１２年■８期 将消化管放人消化炉，定时消化１ ｈ。 （２）蒸馏：福斯特卡托自动蒸馏装置蒸馏。 （３）滴定：取下接收瓶，滴２～３滴甲基红一溴甲 酚绿混合指示剂，用０．１ ｍｏｌ／Ｉ 的标准盐酸溶液滴 定至灰色或蓝紫色为终点，得到盐酸耗用体积Ｖ 。 做空白试验，用盐酸滴定，得到盐酸耗用体积 。 （４）计算： Ｎ一 二 ！ ！ ： ×１ｏ０ ， ｍｌ Ｎ为粗蛋白质质量分数，０Ａ；ｃ为盐酸标准溶液浓 度，ｍｏｌ／Ｌ；Ｆ为蛋白质换算系数，为６．２５；０．０１４为 １ ｍｏｌ／Ｌ盐酸标准溶液１ ｍｌ氮的克数。 １．２．２三氯乙酸氮溶解指数测定 精确称取２ ｇ经发酵酶解后的样品于烧杯中， 加７５ ｍｌ蒸馏水，室温下电磁搅拌４５ ｍｉｎ，摇匀。折 入离心试管中，２ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，收集上清 液（１号上清液）。取１号上清液２５ ｍｌ，加入２５ ｍｌ １０％的三氯乙酸溶液，混合后静置２０ ｍｉｎ。摇匀， 折入离心试管中，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，收集上 清液（２号上清液）。取２号上清液２５ ｍｌ按１．２．１ 凯式定氮法测得小肽质量分数，求得小肽质量分数 与样品粗蛋白质质量分数之比，即为三氯乙酸氮溶 指数（ＴＣＡ—ＮＳＩ）。 ＴＣＡ—ＮＳＩ＝Ｎ１／Ｎ×１００ ， Ｎｘ一 ×１Ｏ０ ， ２八』 Ｎ 为小肽质量分数， ；Ｎ为粗蛋白质质量分 数， ； 为样品馏出液消耗盐酸标准液的体积， ｍｌ；Ｖ。为空白试验消耗盐酸标准液的体积，ｍｌ；Ｃ为 盐酸的摩尔浓度。ｍｏｌ／Ｉ ；蛋白质换算系数为６．２５； ０．０１４为１ ｍｏｌ／Ｌ盐酸标准溶液１ ｍ１氮的克数；ｍ 为测定小肽时称取样品质量，ｇ。 １．２．３脲酶活性定性检测 脲酶定性检测方法：ＧＢ／Ｔ ５４１３．３１ １９９７。 １．３ 试验方法 １．３．１豆粕一次？昆菌固态发酵 将豆粕原料过１０目筛，添加５ 的麸皮混合后 润料４０ ｍｉｎ，使水分的含量在４８ 左右，１２５℃下蒸 料１５ ｍｉｎ，按１：１比例接人０．５ 的黑曲霉和米曲 霉混合菌种，添加０．２ 牛肉膏，３２℃发酵３８ ｈ。 １．３．２磨浆及磨浆补水量对酶解的影响 从同一批次一次发酵豆粕中取出相同四份，以 发酵豆粕质量为基准．添加０．３ ９／６木瓜蛋白酶，按 表２进行补水磨浆，不磨浆为平行试验，物料于５５℃ 酶解４８ ｈ。 表１磨浆补水量试验 １．３．３木瓜蛋白酶添加量对酶解的影响 从同一批一次发酵豆粕中取出相同五份，补水 磨浆，以浆料质量为基准，补３倍水磨浆，按表３添 加木瓜蛋白酶，充分搅拌混匀，于５５℃酶解４８ ｈ。 表２木瓜蛋白酶添加量试验 试验号 １ ２ ３ ４ ５ 加酶量／ ０ ０．１ ０．３ ０．５ ０．７ １。３．４温度与时间对酶解的影响 从同一批次一次发酵豆粕中取出相同１５份，以 浆料质量为基准，补３倍水磨浆、添加０．３ ９／６木瓜蛋 白酶，充分搅拌混匀，于５０、５５、６０℃下分别进行时 间为ｌ２、１８、２４、３６、４８ ｈ的酶解。 表３酶解温度与时间的试验 １．３．５ 二次发酵对生产富肽蛋白的影响 从同一－４ｉｔ次一次发酵豆粕中取出相同四份，以 浆料质量为基准，补３倍水磨浆，添加０．３ 木瓜蛋 白酶于５５℃酶解４８ ｈ后，按表４接入乳酸菌和酵母 菌，３７℃发酵１２ ｈ。 表４乳酸菌和酵母菌发酵试验 试验号 １ ２ ３ ４ 接种 不接种ｌ 乳酸菌１ 酵母菌１ 乳酸菌、酵母菌（１：１） １．３．６ 二次发酵和酶解时间对生产富肽蛋白 的影响 从同一批次一次发酵豆粕取出相同六份，以浆 料质量为基准，补３倍水磨浆，添加０．３％木瓜蛋白 酶于５５℃酶解４８ ｈ，接入１：１的１ 乳酸菌和活性 干酵母混菌于３７℃发酵１２ ｈ，按表５、６时间分配进 行发酵酶解和酶解发酵两个先后顺序不同的试验。 表５二次发酵与酶解时间试验 １．３．７动物饲养试验 将试验产品与蒸汽鱼粉对比进行仔猪饲养试 验。试验期２５ ｄ，地点为自贡市沿滩新六畜猪场，试 验猪品种为土三杂猪．３５日龄断奶仔猪。以饲用价 值及仔猪生产性能等作为参考指标进行比较。 ２结果与讨论 ２．１ 磨浆及磨浆补水量对酶解的影响 磨浆及磨浆补水量对酶解的影响试验结果，见 黄思敏等：酶解及二次发酵豆粕生产富肽蛋白的研究／２０１２年■８期 ■ 图１。 ∞ ∞∞柏 如ｍ ０ 《 籁 裂 腻 不磨浆 ２ ７倍水 ３倍水 土，倍水 图１磨浆及磨浆补水量的影响 从图１可见，氮溶指数随着磨浆补水量增大而 升高。不磨浆时氮溶指数最低，仅５８．２ ；３．３倍水 时最高达６９．３ 。磨浆补水使底物与酶的接触面 积增大，浆液的流动性提高，磨浆速度加快，促进蛋 白质酶解，使氮溶指数提高。加水量由２．７倍增加 至３倍时，氮溶指数增加了４．５个百分点，随着补水 量增加，蛋白质得到充分酶解，由３倍增加至３．３倍 时，氮溶指数只小幅增加１．５个百分点。补水量过 多将加大后期的干燥能耗，增加成本。综合考虑，本 试验选择３倍补水量对发酵料磨浆后进行酶解。 ２．２木瓜蛋白酶添加量对酶解的影响 木瓜蛋白酶添加量对酶解的影响试验结果，见 图２。 ８０ ７０ ６０ 螽５０ ４０ 慈３０ ２０ ｌ０ ０ 酶添加量／％ 图２木瓜蛋白酶添加量的影响 从图２可以看出，未添加木瓜蛋白酶时，氮溶指 数为６２．１３ ，随着木瓜蛋白酶添加量的增大，产品 氮溶指数提高，木瓜蛋白酶添加量为０．７ 时，氮溶 指数达到７３．４５ ，比未添加的氮溶指数提高了 １０．３２个百分点。而当添加量高于０．３ 时氮溶指 数已趋于平稳。 木瓜蛋白酶的添加使酶解反应活化能降低，一 次发酵豆粕中残余的大分子蛋白质进一步被降解为 小分子肽和氨基酸，使产品氮溶指数提高。当添加 ０．３ 的木瓜蛋白酶时，已基本达到充分酶解剩余蛋 白质，继续添加蛋白酶，酶解的促进效果并不显著， 反而增加产品成本。综合考虑，本试验木瓜蛋白酶 的添加量选为０．３ 。 ２．３温度和时间对酶解的影响 酶解温度和时间的对试验结果的影响见图３。 ８０ ７０ ６０ 芝５０ 籁４０ ０ １２ ２４ ３６ ４８ ５４ 时间／ｈ ＋５Ｏ℃＋５５℃＋６０℃ 图３酶解温度与时间的影响 从图３可以看出，随酶解时间的增加，氮溶指数 都先增加后逐渐稳定，当５０℃酶解１２ ｈ时氮溶指数 为最低，仅４９．８ ；当酶解４８ ｈ时，三个温度下氮溶 指数差别微小，都达到７３ 以上。 随着酶解时间增加，产品氮溶指数提高。随着 酶解温度的梯度性增加，酶解反应速度加快，氮溶指 数达到７０ ，５Ｏ、５５、６Ｏ℃分别需要４２、３６、３４ ｈ。但 酶解时间过长或温度过高使体系内碳水化合物很容 易与氨基酸残基发生美拉德褐变反应，产品颜色加 深，影响感官评价，一定程度上降低了产品氮溶指 数。综合考虑，本试验选择５５℃酶解４８ ｈ。 ２．４ 不同菌种二次发酵对生产富肽蛋白的影响 不同菌种二次发酵对生产富肽蛋白的影响试验 结果，如表７。 表７不同菌种的二次发酵对生产富肽蛋白的影响 从表７可以看出，接人１ 酵母菌和１ ９／６混合菌 时，产品的氮溶指数变化不显著，当接人１ 乳酸菌 时，氮溶指数有所降低。但从感官指标分析，接入乳 酸菌和酵母菌可大大改善产品的气味、黏度和口感。 由于二次发酵接入的两种菌为厌氧菌和兼性厌氧 菌，故发酵过程中不搅动，待二次发酵１２ ｈ后进入 酶解阶段，每隔３～４ ｈ搅动一次物料，有助于底物 与酶充分接触，从而促进酶解过程的充分进行。 乳酸菌和酵母菌的接人，一方面使发酵产物生 成一定量的乳酸，降低酶解浆料的ｐＨ值，阻碍蛋白 酶的酶解，使氮溶指数小幅降低，同时浆料ｐＨ值降 低，可抵制有害菌的入侵，软化豆粕，提高动物对豆 粕中矿质元素的利用率，另一方面显著增加大量的 风味物质，使产品具有酸香和酒香且不苦，大大改善 发酵豆粕对动物的诱食性。综合考虑，本试验在磨 浆后，接人１ 乳酸菌和活性干酵母菌混合菌种进 行二次发酵。 ２．５ 二次发酵和酶解时间对生产富肽蛋白的影响 二次发酵与酶解时间对生产富肽蛋白的影响试 ■ 黄思敏等：酶解及二次发酵豆粕生产富肽蛋白的研究／２Ｏ１２年第８期 验结果，见图４。 ８０ ７。６０ ： １ Ｚ ３ 试验号 ■发酵一酶解 口酶解一发酵 图４二次发酵与酶解时间的影响 从图４可见，二次发酵和酶解的前后顺序对氮 溶指数影响不明显，最高都可达７５．４０ ，但二次发 酵时间增加，酶解时间缩短，产品的氮溶指数将降 低。随着发酵时间增加，浆料中乳酸含量增加，浆料 ｐＨ值降低，蛋白酶活性降低，影响酶解效果，同时 酶解时间相对缩短，蛋白质降解不充分，氮溶指数降 低。从感官评价分析，发酵过程在前，酸香酒香气味 更浓郁，适口性更佳。本试验选择先发酵１２ ｈ，后 酶解３６ ｈ。 ２．６脲酶活性定性检测 酶解二次发酵处理后所得富肽蛋白脲酶定性检 测结果成阴性，符合国家关于大豆肽粉行业标 准要求。 ２．７动物饲养试验 动物饲养试验结果，如表８所示。 从表８可见，添加本产品的饲料喂养的仔猪比 用添加鱼粉的饲料喂养的仔猪，总增重多３ ｋｇ，平 均日重多１２ ｇ／头，增重总收入多３６元，料肉比低 ０．０５，耗料成本低９．１元，总毛利多４５．１元，性价比 低０．２６；毛皮更加光滑有亮泽。表明产品不仅可以 代替鱼粉作为仔猪饲料添加剂来使用，而且使用效 果比较鱼粉，动物的生产性能更佳，饲用营养价值更 高，成本更低。 表８动物饲养试验结果 外观指标评定 誊 照组稍乱，试验组 注：对照料３．０８元／ｋｇ；试验组料３．０３元／ｋｇ；仔猪价１２元／ｋｇ。 ３ 结论 （１）通过试验得出，对一次发酵豆粕进行磨浆及 补３倍于一次发酵豆粕量的水可促进酶解，物料的 氮溶指数达６９．３ 。 （２）磨浆补水后，接入１：１的１ 乳酸菌和活 性干酵母混菌，０．３ 的木瓜蛋白酶，３７℃发酵１２ ｈ 然后５５℃酶解３６ ｈ，物料氮溶指数达７５．４０ 。 ［参考文献］ ［１］ 熊智辉，刘晓敏，袁红秀．豆粕的衍生物一发酵豆粕［Ｊ］．饲料与 营养，２００６（１１）：２０—２３． ［２３ 胡敏华，胡民强．小肽营养作用及最新研究进展［Ｊ］．饲料研究， ２００８（６）：２９ ３１． ［３］ 汪梦萍．小肽制品“喂大快”对断奶仔猪生长的影响［Ｊ］．粮食与 饲料工业，２０００（４）：３８ ３９． ［４］袁书林，陈海燕，王宵燕，等．小肽营养研究进展［Ｊ］粮食与饲料 工业，２００２（８）：３７—３９． ［５］吴建忠．大豆蛋白的酶法水解及产物抗氧化活性的研究［Ｄ］． 广卅『：华南理工大学，２００３． ［６］王文娟，宋俊梅，曲静然．黑曲霉发酵豆粕产蛋白酶活性的研 究［Ｊ］．中国酿造，２００７（５）：２３—２６． ［７］吴胜华，李吕木．多菌种发酵豆粕生产小肽饲料［Ｊ］．食品与发 酵工业，２００８（１Ｏ）：１１３－ｌ１５． （责任编辑：梅竹） ＩＬ¨ ｜ 。。 翟－＿＿：¨ ｔ｜ ｜ ｝ 冀Ｉｔ 能 强电器 ｆ Ｉ 也Ｉ 拉 ．＝、Ｚ － － ｉｔ；｝ ｊ囊谚毒雄 静 ： 德 叠 ≤ Ｈ ｌ Ｉ９善 弧 臻ｘ斓 ～ ｛ ｝毒嚣ｔ《 辫 ≥≥・瓢 孙’ ≯ － 为规范饲料原料的生产、经营和使用，保证饲料产 品质量，保障养殖动物产品质量安全，促进饲料行业稳 步发展，根据《饲料和饲料添加剂管理条例》的规定，农 业部于近日发布了《饲料原料目录》（第１７７３号公告， 以下简称《目录》），并于２０１３ Ｏｌ一０ｌ起施行。 《目录》中所称饲料原料，是指来源于动物、植物、 微生物或者矿物质，用于加工制作饲料但不属于饲料 添加剂的饲用物质（含载体和稀释剂），饲料生产食业 所使用的饲料原料均应属于本目录规定的品种，并符 合本目录的要求。按照本目录生产、经营或使用的饲 料原料，应符合《饲料卫生标准》、《饲料标签》等强制性 标准的要求。 《目录》共分四部分：第一部分通则；第二部分饲 料原料加工术语；第三部分饲料原料列表；第四部分 单一饲料品种。 （摘自ＮＹＢ，２０１２－０６－１５）