安徽农业科学。Ｊｏｕｍａｌ ｏｆＡｎｈｕｉ Ａ ．Ｓｃｉ．２００９，３７（９ Ｊ：３９７２—３９７３ 责任编辑张蕾责任校对傅真治 猪Ｈ－ＦＡＢＰ基因内含子３多态片段的序列分析 杨文平 ，李超 ，张红梅 ，吴鹏 ，李明 ，沈海娥 ，王明艳 ，曹果清２，周忠孝２ （１．华北煤炭医学院生物科学系，河北唐山０６３０００；２．山西农业大学动物科技学院，山西太谷０３０８０１） 摘要［目的］为确定影响肌内脂肪（ＩＭＦ）沉积的主效基因奠定理论基础。［方法］以马身猪、大白猪、长白猪、杜洛克猪和山西白猪５个 品种共３８３头猪为试验动物，应用ＰｃＲ－ＳＳＣＰ方法分析猪Ｈ－ＦＡＢＰ基因内含子３部分片段的多态性，并对每个多态片段进行测序分析。 ［结果】在猪Ｈ－ＦＡＢＰ基因内舍子３的３４６位上具有２个等位基因Ａ和Ｂ，该位点的变异由碱基Ａ—Ｇ的替换造成。［结论］在猪Ｈ－ＦＡＢＰ 基因内舍子３发现１个多态位点，为进一步研究Ｈ－ＦＡＢＰ基因与ＩＭＦ含量的关系奠定了基础 关键词Ｈ－ＦＡＢＰ基因；猪；序列分析；ＰＣＲ－ＳＳＣＰ 中图分类号Ｓ８２８ 文献标识码Ａ 文章编号０５１７—６６１ｌ（２００９）０９一ｏ３９７２—０２ ＆娜啪Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆＰｏｌｙｍｏｒｒ￣ｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｎ１ｅ １１１ｉ｜帕Ｉｎｔｒｏｎ ｏｆＰｏｒｃｉｎｅ Ｅ４ Ｇｅｍ ＹＡＮＧＷ ｐｉｌ【ｌｇ ｅｔ ａｌ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ ＣｏａｌＭｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｎｇｓｈａｎ，Ｈｅｂｅｉ ０６３０００） Ａｌ】ｓＩ瑚ｃｔ ［ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＪ Ｉｌ】ｅ ａｉｍ ｏｆｔｈｉｓ ｓｔｒａｙ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓｆｏｒ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｍａｊｏｒ ｇｅｎｅｓ ａｆｆｅｃｔｉｇｎｉｎｌｒａｍｕｓｃｕ＇ｌａｒｆａｔ（ＩＭＦ）ｄｅｐｏｓｉ— ｔｉｏｎ．１Ｍｅｈｔｏｄ］Ｔａｋｉｎｇ ３８３ ｐｉｇｓ ｆｒｏｍ ｉｆｖｅ ｂｒｅｅｄｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｍａｓｈｅｎ ｐｉｇ，Ｉａ ｗｈｉｔｅ ｐｉｇ，ｔｍｉｄｒａｃｅ，Ｄｕｒｏｃ ａｎｄ Ｓｈａｎｘｉ ｈｗｉｔｅ ｐｉｇ ａｓ ｈｔｅ ｅｘｐｅｒｉｎｘｅｎｔａｌ ａｎｉ— ｍａｉｓ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆｐａｒｔｉａｌｆｒａｇｒｆｌｅｎｔｓｉｎｔｈｅｔｈｉｔｄｉｎｔｅｒｎ ｏｆｐｏｒｃｉｎｅＨ－ＦＡＢＰ ｇｅｎｅｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙＰＣＲ－ＳＳＣＰｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅ ｆｌｙｍｏｒｐｈｉｃｆ吨一 ｅｍｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．１ ＲｅｓｕｌｔＩ Ｔｗｏ ａｌｌｅｌｅｓ，ｄｅｓｉｇｎａｔｄｅ ａｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ａｔ ｔｈｅ ｌｏｃｕｓ ３４６ ｉｎ ｔｌ１ｅ ｔｈｉｒｄ ｉｎｔｍｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ Ｈ－ 拍Ｉ尸ｇｅｎｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｎｍｔａｔｉｏｎｗａｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａＡ Ｇ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ．ＩＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｌ Ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｌｏｃｕｓｗａｓ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｉｎｔｈｅｔｈｉｒｄｉｎｔｅｒｎ ｏｆｐｏｒｃｉｎｅＨ－ ４ ｇｅｎｅｉｎｔｈｉｓ ｅｘｐｏｒｉ． ｅｍｎｔ．１ａｙｉｎｇ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｈ－ Ｐ ｇｅｎｅ ａｎｄ ＩＭＦ ｃｏｎｔｅｎｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｈ－ 忸Ｐ ｇｅｎｅ；Ｈｇ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＰＣＲ－ＳｓＩ：Ｐ 随着生活水平的提高，人们对猪肉品质的要求越来越 为２５５ ｂｐ，由北京赛百盛生物工程公司合成。引物序列如下： 高，使得肉质性状的改善在猪的育种目标中１３益重要。据研 Ｆｏｒｗａｒｄ，５＇－ＧＴＧ ＧＡＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＡＧＧ ＡＴ一３ ；Ｒｅｖｅｒｓｅ，５ 一 究，肌内脂肪（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｆａｔ，ＩＭＦ）含量是影响猪肉品质的决 ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＡＧＡ ＡＡＧ Ｃ一３ 。 定因子之一，其与肉的嫩度和风味等食用品质密切相关＿ｌｊ。 １．４基因组ＤＮＡ的提取 按常规的酚一氯仿抽提法提取 中国地方猪的ＩＭＦ含量为３％～７％，明显高于国外猪种＿２ 。 基因组ＤＮＡ。 鉴于心脏脂肪酸结合蛋白（ｈｅａｒｔ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｈ． １．５ ＰｅＲ扩增ＰＣＲ反应体系为２５ ，内含约５０ ｎｇ基因 ＦＡＢＰ）在脂肪酸生成过程中的生物学功能，Ｈ－ＦＡＢＰ基因可 组ＤＮＡ，０．０１ ｍｍｏｌ／Ｌ引物０．８ ｆ』ｌ，２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ ２．５ 作为影响ＩＭＦ含量的候选基因＿３－５ Ｊ。目前，关于Ｈ－ＦＡＢＰ基 ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１２ １．５ ，５ Ｕ／ｌｄ Ｗｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．４ 。ＰＣＲ 因的研究多集中在５ 一上游区和第２内含子的ＰＣＲ．ＲＦＬＰ及 反应程序：９５．０ ｑｃ预变性４ ｍｉｎ；９５．０ ｑＣ １ ｍｉｎ，６７．８℃４５ ｓ， 其与ＩＭＦ的关系等方面 ６ 。有关Ｈ－ＦＡＢＰ基因作为ＩＭＦ ７２．０℃ｌ ｍｉｎ，３０个循环；７２．０℃延伸１０ ｍｉｎ。 侯选基因的研究工作刚刚开始，对侯选基因内多态性的筛选 １．６扩增产物的ＳＳＣＰ分析３／Ａ ＰＣＲ产物和５ 上样缓 还远远不够。 ’ 冲液混合后，９８．０ ｏＣ变性ｌ０ ｍｉｎ，迅速插入冰中，放置１０ ｍｉｎ， 该研究首次对Ｈ－ＦＡＢＰ基因内含子３多态片段进行序 使之保持变性状态。样品在１３％非变性聚丙烯酰胺凝胶 列分析，确定变异位点的位置及引起变异的原因，以期为确 （Ａｃｒ：Ｂｉｓ：３９：１）中电泳。电泳结束后，进行银染显带。 定影响肌内脂肪沉积的主效基因奠定理论基础。 １．７多态片段的测序 根据ＰＣＲ－ＳＳＣＰ结果，分别取２个纯 １材料与方法 合基因型ＡＡ和ＢＢ个体的ＰＣＲ扩增产物，用ＤＮＡ胶快速纯 １．１ 样本来源 在山西省大同种猪场，选取７５头马身猪、 化回收试剂盒纯化回收，回收后的ＤＮＡ送大连宝生物工程 ７Ｏ头大白猪、６３头长白猪、５５头杜洛克猪和１２０头山西白猪， 有限公司测序。所有片段均独立测序２次。 以耳号钳取耳组织，放人７５％乙醇中保存。 ２结果与分析 １．２ 主要试剂 ＤＮＡ聚合酶、丙烯酰胺、甲又双丙烯 ２．１ ＰＣＲ扩增结果 扩增所得ＰＣＲ产物用１．５％琼脂糖凝 酰胺、四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、过硫酸铵、ＤＮＡ胶快速纯化回 胶电泳检测，结果表明：扩增片段与目的片段大小（２５５ ｂｐ） 收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，Ｔｆｉｓ饱 一致且特异性好，见图１。 和酚、乙二胺四乙酸二钠（ＥＩＹＦＡ．２Ｎａ）、十二烷基磺酸钠 ２．２ ＳＳＣＰ检测结果ＰＣＲ扩增产物进行ＳＳＣＰ检测，结果 （ＳＤＳ）、三羟甲基氨基甲烷（啊ｓ）、蛋白酶Ｋ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）、ＲＮＡ 在扩增片段上发现３种基因型，分别命名为ＡＡ、ＡＢ和ＢＢ，如 酶Ａ（ＲＮａｓｅ Ａ）、琼脂糖（Ａｇｒｏｓｅ）、ｄＮＴＰｓ、Ｍａｒｋｅｒ（１００ ｂｐ ＤＮＡ 图２所示。 ｌａｄｄｅｒ Ｉｌ１）购自北京鼎国生物技术发展中心。 ２．３序列分析结果 对比ＰＣＲ—ＳＳＣＰ的２个纯合基因型的 １．３ 引物设计与合成 根据ＧｅｎＢａｎｋ上发表的序列 测序结果，发现猪Ｈ－ＦＡＢＰ基因内含子３核苷酸序列第３４６ Ｉ）Ｑ００２９９３，利用Ｐｒｉｍｅｒ ３．０软件设计１对引物，目的片段长度 位点处Ａ—Ｇ，由此导致等位基因Ａ变为等位基因Ｂ。 ３讨论 基金项目 华北煤炭医学院博士科研启动基金（０７１０１１６８）。 １９９７年，荷兰的Ｇｅｒｂｅｎｓ等按照人和鼠比较图谱的数据， 作者简介 杨文平（１９７１一），女，山西应县人，博士，副教授，从事分子 遗传学研究。 用猪／鼠细胞杂交克隆板（ｄｏｎｅ ｐａｎｅ１）的方法将猪Ｈ－ＦＡＢＰ基 收稿日期 ２ｏｏ８．１２ ２３ 因定位于６号染色体上并测序¨ ０。２０００年，Ｇｅｒｂｅｎｓ等又通 ３７卷９期 杨文平等猪Ｈ－ＦＡＢＰ基因内舍子３多态片段的序列分析 № 啦 ３９７３ 现５ ．上游区ＨｉｎｆＩ． 是由ｌ ３２４位碱基Ｔ—ｃ的突变引 起，ＨａｅＩＩＩ—ＲＦＬＰ是由ｌ ８１１位发生了Ｃ—Ｇ突变引起，第２内 含子区ＨｉｎｆＩ．ＲＦＬＰ（ＨｉＭＩ＊．ＲＦｌ ）是由１ ９７０位发生 ｒ—Ｃ 的碱基替换所导致ｌ】 。以上研究主要集中在５ ．上游区域和 第２内含子区，并初步认为猪Ｈ－ＦＡＢＰ基因这些区域的Ｈｉｎｆ Ｉ．ＲＦＬＰ、 Ⅲ．ＲＦＬＰ和ＨｉｎｆＩ＊．ｍ 位点与肌内脂肪含量 有关［ －５，９，１２， ］。为了寻找更多的基因多态性，丰富遗传标 记，该研究利用ＰＣＲ－Ｓ￣Ｘ＇方法对马身猪、大白猪、长白猪、杜 洛克猪和山西白猪等不同品种猪Ｈ－ＦＡＢＰ基因内含子３的遗 传变异进行分析，发现在内含子３的３，１６位具有２个等位基 因Ａ和Ｂ，由Ａ—Ｇ突变引起。 该研究首次在所选择猪群的Ｈ－ＦＡＢＰ基因内含子３内 发现１个多态位点，并对其多态片段进行了测序分析，确定 ㈣涮湖瑚ｍ 嚣呻够吩 了变异位点的位置和突变的碱基序列，为进一步研究 Ｈ－ＦＡＢＰ基因与ＩＭＦ含量的关系奠定了理论基础。今后，需 继续研究Ｈ－ＦＡＢＰ基因的不同区域，寻找更多的多态性位 点，并扩大群体规模，联合更多相关的侯选基因或ＤＮＡ标记 来进行分析，寻求与ＩＭＦ沉积紧密连锁的遗传标记，以便在 动物育种实践的标记辅助选择（ＭＡＳ）中发挥遗传改良作用。 参考文献 ［１］苏玉虹，熊远著，邓昌彦．堵的肉质性状基因定位研究进展［Ｊ］．遗传， ２０ＯＯ，２２（５）：３３４—３３８． ［２］陈效华．猪育种的理论与实践［Ｍ］．北京：农业出版社，１９９０：３２—３５． ［３］ＧＥＲＢＥＮＳ Ｆ，ＶＡＮ ＥＲＰＡ ＪＭ，ＨＡＲＤＥＲＳＦＬ。ｅｌ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｔｈｅ ｈ朗ｎｆａｔｔｙ ａｃｉｄ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ０ｒＩｉｎｔｍｎａｒ￣ｆａｔ ａｎｄ 憎ｌｍ撇 ｔｒａｉｔｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｐｉｇｓ［Ｊ］．Ｊ伽ｍａｌ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，７７：８４６—８５２． ［４］ＧＥＲＢＥＮＳ Ｆ，ＤＥ ＫＯＮＩＮＧ Ｄ Ｊ，ＨＡＲＤＥＲＳ Ｆ Ｌ＇ｅｌ ａ１．ｑｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ０ｆ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ 注：１、４、５为ＢＢ基因型；６一ｍ为ＡＡ基因型；２、３为ＡＢ基因型。 ａｎｄ ｈｅａｒｔｆｌ啦Ｉｙ－ 小ｂｉ 肾 埴ｄｎ ｇｅｎｅｓ∞Ｉｎ畹啊啦ｄｄ ｆａｔ ａｎｄ［￣ｅｋｆａｔ ｅ嘶・ ｔｅｎｔ ｉｎ Ｍｅｉｓｈａｎ ｃｒｏｓｓｂｒｅｄ ｐｉｇｓ［Ｊ］．Ｊａａｎａｌ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｅｅ，２Ｏ０Ｏ，７８（３）：５５２ Ｎｏｔｅ：１．４ ａｎｄ ５．ＢＢ ｇｅ￣ｑｐｅ；６－１０．ＡＡ ｇｅｎ￣ｙｐｅ；２＇ａｎｄ ３．ＡＢ ｇｅｒ￣）ｐｅ —５５９． 图２猪Ｈ－ＦＡＢＰ基因内含子３部分片段ＳＳＣＰ分析 ［５］ＧＥＲＢＥＮＳ Ｆ，ＶＥＲＢＵＲＧＦ Ｊ，、ｌ￣Ｎ ＭＯＥＲＫＥＲＫＨＴＢ，ｅｔ ａ１．Ａｓｓｏｃｉａｔｉ￣ｓ Ｆｉｇ・２ ＰＡＧＥ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆｌｍａｉｃａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ ｉｎｔｒｏｎ３ ｏｆｐｏｒｃｉｎｅ １ｔ－ ｈｅ毗ａｎｄ ａｄｉｐｏｃ￣ｅｆａｔｔｙ ａｃｉｄ—ｂｉｎｄｉｇｎｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ￣￣ｉｔｌｔｌ ｗｉｔｈｉｎｔｍｒｕｓ一 诅ｌ１ ｆａｔ ｃ０ｎｔ嘲ｔｉｎｐｉ￣［Ｊ］．Ｊａｍａｌ ａｆＡｎｉｍａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，７９（２）：４３７—３５４． ＦＡＢＰ ｇｅａｅ ｂｙ ＳＳＣＰａｎ￣ｒｓｔｓ ［６］李桢，曹红鹤，储明星，等．中外１１个猪种Ｈ－ＦＡＢＰ基因ＰＣＲ－￣ＩＰ的研 过遗传连锁图谱分析将１ｔ－ＦＡＢＰ基因精确定位于６号染色体 究［Ｊ］．畜牧兽医学报，２ＯＯ３，４３（４）：３１３—３１７． 的ＳＷ３７６ ［５．１］．Ｈ．ＦＡＢＰ－［１Ｉ．５］．，￣０００３ ，Ｌ４。现已确定Ｈ－ＦＡＢＰ ［７］林万华，黄路生，任军，等．中外十个猪种Ｈ．ＦＡＢＰ基因遗传变异的研究 ［Ｊ］．遗传变异，２Ｄ ，２９（１）：１２—１５． 基因序列含有１．６－ｋｂ的上游调控区和０．２ ｋｂ的３’非转录区， ［８］张桂香，曹红鹤，王立贤，等．九个猪种Ｈ－ＦＡＢＰ基因５ ．上游区和第二 ４个外显子分别编码２４、５８、３４和ｌ７个氨基酸，３个内含子的 内含子的遗传变异［Ｊ］．畜牧兽医学报，２∞２ ３３（４）：３４０—３４３． ［９］杨文平，曹果清，刘建华，等．猪Ｈ－ＦＡＢＰ基因多态性与肌内脂肪含量 大小分别为４．２、２．５和１．５ ｋｂ 利用限制性内切酶Ｈｉｎｆ Ｊ、 的关联分析［Ｊ］．激光生物学报，２０Ｏ７，１６（５）：５９９—６０２． Ⅲ和Ｍｓｐ Ｉ，对荷兰长白猪、杜洛克、大约克、汉普夏、梅山 ［１Ｏ］梅书棋，彭先文，李勇，等．，￡脏型脂肪酸结合蛋白基因多态性在湖北 白猪中的初步研究［Ｊ］．华中农业大学学报，２Ｏ０４，２３（２）：２２７—２２９． 猪、皮特兰及野猪的Ｈ－ＦＡＢＰ基因的ＰＣＲ．ＲＦＬＰ分析结果表 ［１１］庞卫军，杨公社，曹景峰，等．猪Ｈ－ＦＡＢＰ基因ＰＣＲ－ＲＨＰ分子标记研究 明，ＨｉｎｆＩ酶切位点位于５ 上游区域，ＨａｅＨｔ和Ｍｓｐ ｌ酶切位 ［Ｊ］．西北农林科技大学学报：自然科学版，２ＯＯ４，２３（７）：１１—１５． ［１２］林万华，任军，丁能水，等．Ｈ－ＦＡＢＰ基因型对二花脸猪相关性状影响 点位于第２内含 内ｌ】 。张桂香等（２ｏｏ２）以相同方法对皖 的初步研究［Ｊ］．畜牧兽医学报，２００３，３４（４）：３１８—３２４． 南花猪、二花脸猪、金华猪、小梅山猪、滇南小耳猪、香猪、荣 ［１３］ＧＥＲＢＥＮＳ Ｆ，ＲＥ】 ＢＩ强Ｇ踊Ｇ，ＩＥＮＳＩｌｌＡ】Ａ，ｅｌ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ｄ呱ｍ幻Ｂ０Ｈ码ｌ ｋ￣ｌｉｚａｔｎｉｎ ａｎｄ晷舯鲥ｃ ｍ＇ｉａｔｉｏｎ ｏｆｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｂｅａｎ ｆ￣＇ｔｙ ａｄｄ－ 昌猪、北京黑猪、大白猪９个品种猪的Ｈ－ＦＡＢＰ基因进行研 ｂｉｎｄｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍ［Ｊ］．Ｍａｒｔｉｎ ｌⅫｍ．１９９７，８（５）：３２８—３３２． 究，结果发现， ｎｆＩ－ＲＶＬＰ存在于５ ．上游区域和第２内含子 ［１４］曹红鹤，张桂香，王立贤，等．猪Ｈ－ＦＡＢＰ基因多态片段的序列分析 ［盯．遗传，２０（１２（２）：１４６—１４８． 区， ｍ．ＲＦＬＰ存在于第２内含子中镥 。曹红鹤等（２ｏ０２）发 【ｌ５］王存芳．猪Ｈ－ＦＡＢＰ和Ａ－ＦＡＢＰ基因的多态性及其与肌内脂肪性状关 系的研究［Ｄ］．泰安：山东农业大学，２００２．