维普资讯 http://www.cqvip.com Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｅｓｔ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍａｙ． ２００６ Ｎｏ．３ 木霉菌和毛壳菌对板栗疫病的抗生作用 何邦令 ，李超２，王庆华２，姜培红３，高克祥３，商金杰４ （１．山东农业大学科技学院，山东泰安３．山东农业大学植保学院，山东泰安２７１０００；２．泰安市徂徕山林场，山东泰安２７１０１８；４．东营市林业局，山东东营２７１０００； ２５７０００） 摘要：哈茨木霉Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ Ｔ８８菌株、深绿木霉Ｔ．ａｔｒｏｖｏｒｉｄｅ Ｔ９５菌株和螺旋毛壳 Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐｉｒａｌｅ ＮＤ３５菌株与板栗疫病菌Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ＬＹ菌株的平板对峙培养结 果表明，木霉菌对营养和空间有强烈的竞争作用，表现在可使病原茵茵丝消解，对病菌茵丝的生长 有明显的抑制作用；毛壳茵生长速度较慢，但可形成抑茵带，使病菌不扩展。室内水培枝条接种试 验结果表明，接种拮抗茵的拮抗效果好，而且先接种拮抗茵后接种病原茵的处理比拮抗茵和病原茵 同时接种的处理效果还好，毛壳茵没有木霉菌的作用明显。接种枝条的木霉菌、毛壳茵和病原茵的 再分离结果表明，Ｔ９５和ＮＤ３５的定殖能力强。 关键词：木霉菌；毛壳茵；板栗疫病菌；拮抗作用；重寄生 中图分类号：Ｓ７６３．１５文献标识码：Ａ文章编号：１６７１—０８８６（２００６）０３—０００４—０４ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｎｄ Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ａｇａｉｎｓｔ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｂｌｉｇｈｔ ｃａｌｌｓｅｄ ｂｙ Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｒｉａ ｐａｒａ－ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉ’ａｎ ｓｉｔｉｃａ／ＨＥ Ｂａｎｇ—ｌｉｎｇ，ｅｔ ａ１．（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ２７１０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ（Ｔ８８），Ｔ．ａｔｒｏｖｏｒｉｄｅ（Ｔ９５）ａｎｄ Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐｉ— ｒａｌｅ（ＮＤ３５）ｉｎ ｄｕａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ（ＬＹ）ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ８ ａｎｄ ５ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐａｃｅ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ，ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｈｙｐｈａｅ ｗａｓ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｇｒｏｗｔｈ ｗａｓ ｉｎｈａｂｉｔｅｄ、Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｌｓｏ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｃｈ．ｓｐｉｒａｌｅ ｗｉｔｈ ａ ｌｏｗ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｍｐｅｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐａｃｅ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ，ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｈｙｐｈａｅ ｗａｓ ｎｏｔ ｅｎｌａｒｇｅｄ ａｎｄ ｆｏｒｍｅｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉ— ｂｉｔｉｏｎ ｂｅｌｔ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ．Ｔｈｅ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ Ｃ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｓｈｏｏｔｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ丁 ｃｈｏｄｅｒｍａ ｗａｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ．ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ａｆｔｅｒ ｔｈａｔ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｄ ｂｅｔｔｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｈ．ｓｐｉｒａｌｅ ｈａｓ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｅｆ— ｆｅｃｔ ｗｉｔｈ Ｔ ｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｈｅ ｒｅｉｏｌｓａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｏｆ Ｔ ｃｈｏｄｅｒｍａ．Ｃｈ．ｓｐｉｒａｌｅ ａｎｄ Ｃ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｓｈｏｏｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｔ９５ ａｎｄ ＮＤ３５ ｈａｄ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ；Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ；Ｃｒｙｐｈｏｎｅｔｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ；ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ；ｈｙｐｅｒｐａｒａｓｉｔｅ 板栗疫病［Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ（Ｍｕｒｒ．） Ｍａｒｒ．，异名为Ｅｎｄｏｔｈｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ（Ｍｕｒｒ ）Ｐ．Ｊ．ｅｔ Ｔ９５对苹果轮纹病进行生防研究证明，木霉菌对苹 果轮纹病有抑制作用，而且刮除病组织后喷洒木霉 Ｈ’Ｗ Ａｎｄｅｒｓｏｎ］又称干枯病、胴枯病、溃疡病，是重 要的经济林病害之一，世界各地均有分布。 木霉菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ 是植物病害防治中研 究应用较多的拮抗真菌，具有广谱性、适应性强、多 菌的孢子悬浮液还能有效地促进伤口愈合。高克祥 等还用木霉菌株Ｔ８８和Ｔ９５对杨树烂皮病和苹果 树腐烂病进行生物防治＿３ Ｊ，也收到了良好的效果。 毛壳菌Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐｐ 在自然界中广泛分 机制性等特点，主要应用在土传病害的防治中，对林 果枝干、果实病害的防治研究报道甚少…１。 布，并具有广谱拮抗性和较强的抗逆性。毛壳菌的 收稿日期：２００５—０６一ｌ２ 作者简介：何邦令（１９６３一），山东郓城人，副教授，主要从事林果病害 教学与研究工作 茆振川Ｉ等报道了木霉菌对感染苹果枝条的轮纹 病有抑制作用。高克祥等＿２ｊ应用木霉菌株Ｔ８８、 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国森林病虫 ２００６年５月 第２５卷 第３期 子囊孢子寿命长，对干燥、低温等不良环境的抵抗能 力强，是一种比较理想的生防真菌。据文献记载，毛 ・ ５ ・ 原菌菌丝块，进行烫伤接种ｌ４ Ｊ，用脱脂棉蘸无菌水 保湿，然后用塑料薄膜包扎。每天给脱脂棉滴水２ 壳菌对多种植物病菌有拮抗作用，如对腐霉菌、丝核 菌、镰刀菌等引起的棉花、高梁等农作物的种子腐烂 和种苗猝倒及小麦颖枯病、稻瘟病等有明显的抑制 作用。毛壳菌在国内报道少，国外虽然很多国家在 研究，但在林木病害防治方面也很少，所以毛壳菌在 林木病害生防方面的开发应用还有很大的潜力。 本试验研究了哈茨木霉Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ 次，７ ｄ后解除包扎，逐Ｅｌ观察记录发病情况。上述 接种试验分为拮抗菌和病原菌同时接种和先接拮抗 菌，５ ｄ后再接病原菌２种处理，并设只接病原菌而 不接拮抗菌的枝条为对照。每种处理均为９根枝 条，枝条水培，每天换水。接种结果以接种枝条出现 病菌子实体的早晚作为发病程度的分级标准。０ 级：病菌的分生孢子器在接种２９ ｄ以后出现；１，２， ｈａｒｚｉａｎｕｉｎ、深绿木霉Ｔ．ａｔｒｏｖｏｒｉｄｅ和螺旋毛壳 Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐｉｒａｌｅ对板栗疫病菌的室内拮抗作用 及拮抗机理，并进行了水培枝条的人工接种试验及 再分离试验。 １材料与方法 １．１ 材料 菌种来源：拮抗菌株为哈茨木霉Ｔ８８ 菌株（以下简称Ｔ８８）、深绿木霉＂１－＇９５菌株（以下简 称＂Ｉ＂９５）、螺旋毛壳ＮＤ３５菌株（以下简称ＮＤ３５）。 病原菌：板栗疫病病菌ＬＹ菌株（以下简称 ＬＹ）。 以上菌种均为本院实验室保存。 培养基：ＰＤＡ培养基（马铃薯２００ ｇ，琼脂１８ ｇ， 葡萄糖２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ）。 植物寄主：板栗新丰品种２～３ ａ生枝条。 １．２方法 １．２．１ 平板对峙培养法用孔径０．５ ｃｍ的打孔器 切取新鲜拮抗菌及病原菌的菌丝块接种于ＰＤＡ平 板上距中心２ ｃｍ处同一直线的两点上，于２５℃恒 温培养，并逐日观察、测量拮抗菌的菌落指向病原菌 的半径，病原菌菌落指向拮抗菌的半径以及只接病 原菌的半径，并以只接拮抗菌的菌落半径为对照半 径，精确到ｍｍ。当两菌落接触相交后，观察记载拮 抗菌对病原菌的抑制、包围、侵入并占领病原菌营养 空间的过程。 １．２．２载玻片培养观察 用灭菌的解剖刀划取１ ｃｍ×１ ｃｍ的ＰＤＡ培养基薄膜，置于灭菌的载玻片 中央，然后挑取等量的病原菌丝块分别接种于薄膜 两边的中点，加盖玻片，置于２５℃下恒温保湿培养。 由于病原菌生长较慢，可先接病原菌，２ ｄ后接毛壳 菌，３ ｄ后接木霉菌，逐日镜检观察两菌的相互作用。 １．２．３接种试验将新丰板栗的２～３ ａ生枝条用 清水洗净后晾干，剪成２９ ｃｍ的小段，并用酒精进行 表面消毒，顶端封上石蜡防止水分蒸发，用孔径０．５ ｃｍ的打孔器切取培养３ ｄ的拮抗菌和培养６ ｄ的病 ３，４级依次为在接种２５～２８ ｄ，２１～２４ ｄ，１７～２０ ｄ， １６ ｄ内出现。根据上述标准逐Ｅｌ观察记载，统计计 算不同的发病率、病情指数和拮抗效果。 发病率（％）＝发病枝条数／手妾种枝条总数×１００ 病情指数＝（∑各级代表值×各级发病枝条 数）／（最高级代表值×总枝条数）×１００ 拮抗效果（％）＝（对照病情指数一各处理病情 指数）／对照病情指数×１００ １．２．４接种枝条的再分离 从接种枝条的烫伤部 位周围随机取样，每根枝条取５块树皮，每组３个重 复，每个重复３根枝条，每个重复的树皮用１块纱布 包好，先在７Ｏ％酒精中浸泡３０ Ｓ，然后在升汞中消 毒４ ｍｉｎ，再用无菌水清洗３次，在ＰＤＡ平板上进行 ５点培养。检测拮抗菌在枝条上的定殖能力，以了 解拮抗菌的拮抗效果。每个处理设４个重复，于２５ ℃恒温培养，统计分离率。 ２结果与分析 ２．１ 平板对峙培养观察结果与分析 由于木霉菌 生长速度快，２ ｄ时Ｔ８８与病原菌开始相交，并限制 病原菌的生长速度，二者呈对峙之势。３ ｄ时，Ｔ８８ 侵入病菌菌落，并覆盖病原菌。５ ｄ时，Ｔ８８在病原 菌菌落上产生大量分生孢子，６ ｄ时，与Ｔ８８对峙培 养的病原菌的气生菌丝开始消解，菌落变薄。２ ｄ 时，Ｔ９５与病原菌开始相交，与病原菌呈对峙之势，３ ｄ时，Ｔ９５开始侵入病原菌菌落，病原菌菌落生长变 慢，５ ｄ时，Ｔ９５开始从四周向病原菌中央覆盖，但只 覆盖与Ｔ９５接近的一部分菌落，６ ｄ时，病菌菌落达 到最大，达１．５６ ｃｍ，以后逐渐减少，８ ｄ时，覆盖处 产生大量孢子，气生菌丝消解，菌落变薄，但没有 ８明显。与Ｔ８８相比，Ｔ９５对峙培养的病菌半径 与对照相比要小得多，且 ５＜Ｔ８８。可见，Ｔ８８、 Ｔ９５对板栗疫病菌有很强的抑制作用。Ｔ８８与ＬＹ、 Ｔ９５与ＬＹ的对峙培养曲线分别见图１、图２。 维普资讯 http://www.cqvip.com ・ ６ ・ Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｅｓｔ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍａｙ． ２００６ Ｎｏ．３ 图１ Ｔ８８与ＬＹ的对峙培养曲线 毛壳菌生长速度缓慢，４ ｄ时，才开始与病原菌 接近，毛壳菌丝不侵入病原菌菌落，而是形成抑菌 带，相接处的病原菌菌丝萎缩。病菌的对峙半径与 对照相比要小，但比Ｔ８８、Ｔ９５的组合要大。可见， 毛壳菌可以占领空间从而抑制病原菌的生长，但没 有Ｔ８８、Ｔ９５明显。ＮＤ３５与ＬＹ的对峙培养曲线见 图３。 平板对峙培养的图片见图４，５，６，７。 ２．２重寄生现象的观察结果通过载片培养直接 图４ ＮＤ３５与ＬＹ的平板对峙培养 图６ Ｔ９５与ＬＹ的平板对峙培养 观察的结果可见，木霉可以贴近病菌菌丝平行生长， 通过吸器伸入病菌菌丝内吸取营养，有的可在病菌 菌丝上轻微缠绕生长，还有的可以在病原菌的体细 胞中贯穿生长。通过以上几种方式，木霉使病原菌 图２ Ｔ９５与ＬＹ的对峙培养曲线 图３ ＮＤ３５与ＬＹ的对峙培养曲线 图５对照（只接病原茵） 图７ １＂８８与ＬＹ的平板对峙培养 生长受到抑制，甚至遭到破坏。毛壳菌没有观察到 以上几种现象。 ２．３接种试验从表１中数据可见，Ｔ９５不论先接 种还是与病原菌同时接种，都有明显的拮抗作用，先 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国森林病虫 ２００６年５月 第２５卷 第３期 ・ ７・ 接种Ｔ８８比同时接种效果好。原因是先接种木霉 菌优先占领营养空间，从而限制和阻碍病原菌的侵 入和生长，所以拮抗作用得以充分发挥，发病率和病 情指数均很低。同时接种由于病原菌与枝条的亲和 力较木霉强，可在短时间内侵入寄主，占领空间，使 木霉的拮抗作用在短时间内得不到发挥。２１ ｄ后， Ｔ８８逐渐占优势，在烫伤部位可形成愈伤组织。 ５比Ｔ８８生长快，因此，Ｔ９５的拮抗作用要比Ｔ８８ 强。毛壳菌在一定程度上也能降低枝条的发病率和 病情指数，也表现一定的拮抗作用，但没有Ｔ９５、 Ｔ８８作用明显。 表１室内水培枝条不同接种方式的拮抗效果 接种方式Ｔ９５ Ｔ８８ ＮＤ３５＂Ｉ＂９５＋ＬＹＴ８８＋ＬＹ ＮＤ３５＋ＬＹ ＬＹ Ｔ９５，Ｔ８８，ＮＤ３５均为５ｄ后再接种ＬＹ：Ｔ９５＋ＬＹ，Ｔ８８＋ＬＹ， ）３５＋ＬＹ均为与Ｉ Ｙ同时接种；ＬＹ为病原菌；下表同 ２．４接种枝条拮抗菌和病原菌的再分离 由表２ 中数据可知，不论是先于病原菌接种拮抗菌还是混 合同时接种，拮抗菌的分离率均是Ｔ９５＞ＮＤ３５＞ Ｔ８８。对Ｔ９５、ＮＤ３５而言，同时接种的处理的分离 率均高于先接种拮抗菌的处理的分离率，但Ｔ８８正 好相反，先接种的处理的分离率高于同时接种的处 理的分离率。与对照相比，Ｔ９５与ＬＹ同时接种和 ＮＤ３５与ＬＹ同时接种的处理在ａ＝０．０５的水平上 有差异，而在ａ＝０．０１的水平上差异明显。可见， ５和ＮＤ３５的定殖能力强。 表２不同处理对拮抗菌和病原菌分离的影响 ａ，ｂ，Ｃ为ａ＝０．０５水平上的差异显著性；Ａ，Ｂ为ａ＝０．叭水平 上的差异显著性 由表２中数据也可看出，在先于病原菌接种木 霉菌Ｔ８８、Ｔ９５的枝条上和Ｔ９５与病原菌同时接种 的枝条上都没有分离到病原菌，同时接种的处理的 分离率高于先接种拮抗菌的处理的分离率，且 ＮＤ３５＞Ｔ８８。与对照相比，其它处理在ｎ＝０．０５水 平上都有差异，而在ａ＝０．０１水平上，先接种Ｔ９５、 Ｔ８８、ＮＤ３５后接种病原菌的处理及Ｔ９５与病原菌混 合接种的处理中差异显著。由此可见，ＮＤ３５与病 原菌同时接种和Ｔ８８与病原菌同时接种的处理中 病原菌的定殖能力强。 ３讨论 木霉菌和毛壳菌作为普遍存在的并具有丰富资 源的拮抗微生物，在植物病害生防中具有重要的作 用。不同的种或同种的不同菌株存在着拮抗活性的 差异及拮抗对象种类的差别。 平板对峙试验结果表明，供试的木霉菌Ｔ８８、 Ｔ９５菌株均能有效地抑制病原菌的生长，表现为强 烈的营养和空间的竞争作用，且Ｔ８８强于Ｔ９５。毛 壳菌可占领营养空间，使病原菌不扩展。拮抗机理 的显微观察结果表明，木霉菌的菌丝能贴着病原菌 的菌丝平行生长或轻微缠绕生长或穿透病菌的菌丝 生长，使病菌的菌丝细胞壁变薄，原生质浓缩。毛壳 菌没有观察到类似现象。 水培枝条接种试验及再分离试验结果表明，木 霉菌和毛壳菌均能在枝条上定殖生长，对病原菌有 一定的抑制作用。接种拮抗菌的发病率和病情指数 均小于对照，先接种拮抗菌的处理的发病率和病情 指数小于同时接种的发病率和病情指数，且木霉菌 Ｔ９５比Ｔ８８的分离率高，拮抗效果好，表明先接种 木霉菌使其优先占领营养空间，对病原菌的拮抗效 果更佳。毛壳菌的分离率也很高，但不论是先于病 原菌接种的处理还是同时接种的处理，其病菌的分 离率也较Ｔ９５、Ｔ８８高，但比对照的要少，表明毛壳 菌对病原菌有一定的抑制作用，但没有木霉菌的拮 抗效果好。 参考文献 ［１］高克祥，刘晓光，姜培红，等．木霉对杨树水泡溃疡病的拮抗作 用［Ｊ］安徽农业大学学报，１９９９，２６（增刊）：８０—８４． ［２］ 高克祥，刘晓光，姜培红，等．苹果轮纹病的生物防治研究 ［Ｇ］／／山东植物病理学会．山东植物病理研究：第２集．北京： 中国农业科技出版社，２００１ ［３］高克祥，刘晓光，姜培红，等．木霉菌防治苹果树腐烂病的研究 ［Ｊ］．林业科学研究，２０００，１３（专）：８ｌ一８５． ［４］方中达植病研究方法［Ｍ］３版北京：中国农业出版社， １９９８． （责任编辑杨静莉）