｛ 镳蛆２０１２，３８（２）：６６—７０ 白僵菌培养基继代培养对蛋白酶（ｃｄｅｐ１）、 几丁质酶（ｃｈ／ｔ１）基因表达的影响 孙召朋 ｚ， 张正坤 ， 徐文静 ， 汪洋洲 ， 潘洪玉 ， 李启云 （１．吉林大学，长春１３００６２； ２．吉林省农业科学院，长春１３００３３） 摘要［目的］对球孢白僵菌Ｄ６—２和Ｉ １一ｌ菌株进行室内培养基继代培养，比较其不同世代之间毒力及毒力相关基 因表达－ｅ＿＿Ｎ的差异。［方法］对目的菌株进行室内生物测定，用Ｉ Ｔ 。和Ｉ Ｔ ｏ作为毒力评价标准来检测不同世代之 间毒力的变化情况。为了明确继代培养对球孢白僵菌毒力相关酶基因表达情况的影响，以１８８ ｒＤＮＡ基因为内参， 利用半定量ＲＴ ＰＣＲ对蛋白酶ｃｄｅｐｌ基因和几丁质酶ｃｈｉｔ１基因的表达情况进行检测。［结果］在ｌＯ 孢子／ｍＩ 供 试浓度下，随着世代的更替，两个供试菌株Ｆ 代相比于Ｆ 代，其Ｉ ．．和Ｉ Ｔ 降低，说明其对玉米螟的毒力有所增 强。而两个供试菌株Ｆ ～ＦＩ代对玉米螟的毒力呈下降趋势。在内参基因稳定表达的情况下，两个供试菌株Ｉ １ １ 和Ｄ６ ２的ｃｄｅｐｌ基因和ｃｈｉｔｌ基因在Ｆ 和Ｆ 代表达稳定，随着继代次数的增多，供试菌株两个基因的表达量均呈 下降趋势，这与对亚洲玉米螟毒力测试的结果呈正相关性。［结论］Ｆｚ代毒力和毒力酶基因表达最强，Ｆ１代与Ｆｚ 代基本相似或略低于 代，Ｆｚ～Ｆ［代毒力和毒力酶基因表达依次减弱。 关键词球孢白僵菌； 继代培养； 毒力； 毒力相关酶基因； 半定量ＲＴ－ＰＣＲ 文献标识码： Ａ ＤＯＩ： １０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９—１５４２．２０１２．０２．０１３ 中图分类号： Ｓ ４７６．１２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ ｄｕｒｉｎｇ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｏｎ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｃｄｅｐ１ ａｎｄ ｃｈｉｔ １ ｇｅｎｅｓ Ｓｕｎ Ｚｈａｏｐｅｎｇ ．Ｚｈａｎｇ Ｚｈｅｎｇｋｕｎ ，Ｘｕ Ｗｅｎｊｉｎｇ ，Ｗａｎｇ Ｙａｎｇｚｈｏｕ２，Ｐａｎ Ｈｏｎｇｙｕ ，Ｌｉ Ｑｉｙｕｎ （１．Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００６２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｊｉｌｉｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００３３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ ｆｏｒ ５ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｖｉｒ— ｕｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １ｅｖｅｌ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ．［Ｍｅｔｈｏｄ］Ｔｈｅ ｃｏｎｉｄｉａ ｏｆ ｔｗｏ ｓｔｒａｉｎｓ Ｏｆ Ｂ．ｂａｓｓｉａｎａ，Ｄ６ ２ ａｎｄ Ｌ１—１．ｗｅｒｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｎ ＳＤＡＹ ｍｅｄｉｕｎ￣Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｇｅｎｅ，ｃｄｅｐｌ ａｎｄ ｃｈｉｔ１ ｏｆ ｂｏｔｈ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｅｓｔｅｄ，ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｅｍｉ—ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ，ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｂｉｏａｓｓａｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｉ．Ｔｓｏ ａｎｄ Ｉ Ｔ９（）ｏｆ Ｆ２ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｆ１ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｓｕｂｃｕｌｔｕ— ｒｉｎｇ，ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｆ２ ｔＯ Ｆ５ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｄｅｃｌｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｄｅｐｌ ａｎｄ ｃｈｉｔ１ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎ Ｆｌ ａｎｄ Ｆ２ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｅｓｔｅｄ， ｂｕｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ，ｄｅｃｌｉｎｅｄ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔＷＯ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ； ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ； ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ； ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ： ｓｅｍｉ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ ＰＣＲ 白僵菌（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ）是目前国内生物 防治中应用最广泛的昆虫病原真菌 ，具有防治害 虫效果好，不伤害天敌，对人、畜、植物无毒害，容易 大量生产，无残毒，害虫不易产生抗性等优点 ｚ－，在 玉米螟和松毛虫等的防治中已取得很好的防效 引。 研究表明，在穿透寄主体壁的过程中，球孢白僵菌会 产生多种降解酶。在穿透昆虫体壁的早期，昆虫病 原真菌高水平表达蛋白酶，降解昆虫的体表蛋白＿４］。 同时，也表达用于降解昆虫体壁的主要组成成分几 丁质的几丁质酶 。球孢白僵菌在防治应用中菌种 鉴 旦翅：２蓦龛疆旦ｐ１１—０４—１５ ： ＊通信作者 Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｙｌｉ１２２５＠ｖａＫ ｏ．。ｃｏ … 一…一 吉林省科技厅科技 殍计划蚩点资助项目（２００８０２４９） 修订日期：２０１ｌ一０６—１９ ３８卷第２期 孙召朋等：向僵菌培养基继代培养对蛋白酶（ｃｄｅｐ１）、几丁质酶（ｃｈｉｔ１）基因表达的影响 ・６７・ 资源主要来源于自然直接筛选的菌株，生产的菌株 “退化”是防效不稳定的重要原因之一。高毒力菌株 经多代培养后毒力退化的现象已被认识［６］，但原因 不是十分清楚。本研究对两株田问采集分离的野生 白僵菌菌株进行了培养基继代培养，通过对亚洲玉 米螟的室内毒力测定，评价了继代培养对白僵菌毒 力的影响。同时，明确了每一世代白僵菌蛋白酶和 几丁质酶基因的表达水平，分析了继代培养对白僵 菌毒力及其蛋白酶和几丁质酶基因的影响。 １材料与方法 １．１ 试验材料 供试昆虫：亚洲玉米螟公主岭种群Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ（Ｇｕｅｎ６ｅ）］２龄幼虫，南吉林省农业科学 院植物保护研究所汪洋洲博士提供。 供试菌株：球孢白僵菌Ｄ１—５和Ｄ６—２分离自德 惠市玉米田的玉米螟僵虫虫体，南本实验室沙土管 保存于一８０”Ｃ超低温冰箱（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ）。 １．２主要试剂 限制性核酸内切酶ＥｃｏＲ Ｉ、ＨｉｎｄⅢ购自ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ购自上海生工，琼脂糖为 Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司产品，总ＲＮＡ抽提试剂盒为大连宝生 物工程有限公司（ＴａＫａＲａ）产品。所用无水乙醇、异 丙醇、氯仿等有机溶剂为中同医药（集团）上海化学 试剂公司产品，均为分析纯。 １．３室内毒力测定 １．３．１ 白僵菌供试菌株的继代培养 将供试菌株在无菌条件下从沙土管接种在 ＳＤＡＹ培养基（质量浓度４ ）葡萄糖，１ 蛋白胨， ２ 酵母膏，ｐＨ７．Ｏ），为Ｆ 代，培养２０ ｄ左右后刮取 孢子，将孢子制备成１×１０ 个／ｍＬ浓度的孢子悬 液，涂布于ＳＤＡＹ培养基，共进行Ｆ。～Ｆ 代培养， 每个菌株各世代培养１Ｏ皿，收集每个世代孢子，均 配制成１×１０ 孢子／ｍＩ 浓度的孢子悬浮液供试。 １．３．２萌发率的测定 取相同量菌悬液接种于ＳＤＡＹ培养基中（终浓 度为１×１０ 孢子／ｍＩ ），２６℃培养１６ ｈ，测其萌发 率，每个菌株重复３次。 １．３．３ 室内生物测定方法 将室内饲养、龄期一致的２龄玉米螟幼虫浸入 １×１０ 孢子／ｍＩ 的孢子悬液中５～１０ Ｓ后，用滤纸 吸去多余药液，将试虫转移到正常条件下饲养。每 处理４次重复，每重复浸虫２０头，并设无菌水处理 作为对照。在黑暗环境下培养１０ ｄ，每天记录被白 僵菌感染的试虫数。 １．３．４数据统计与分析方法 根据调查数据，计算各处理的校正死亡率，公式 如下： 死亡率（Ｐ ）一死亡虫数（Ｋ）／ 处理总虫数（Ｎ）×１００ ； 校正死亡率（Ｐ ）一［处理死亡率（尸ｆ）一空白对 照死亡率（Ｐ。）］／［１一空白对照死亡率（Ｐ。）］； 利用ＤＰＳ分析软件进行统计分析数据。 １．４半定量ＲＴ－ＰＣＲ检测继代培养对白僵菌蛋白 酶、几丁质酶基因表达的影响 １．４．１样品收集及总ＲＮＡ提取 从培养供试菌株的ＰＤＡ培养基上刮取１００ ｍｇ 分生孢子，采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取总ＲＮＡ。利用紫外分 光光度计测定各处理中总ＲＮＡ的浓度，并保证 Ａ。∞／Ａ。。。比值在１．８～２．０之间，以确保总ＲＮＡ 纯度。 １．４．２ 半定量ＲＴ—ＰＣＲ［ １ ］ 利用紫外分光光度计测定样品ＲＮＡ浓度，每 个处理上样量为５０ ｎｇ总ＲＮＡ，利用蛋白酶 （ｃｄｅｐ１）（ＡＹＯ４Ｏ５３２．１）、几丁质酶（ｃｈｉｔ１）（ＡＹ１４５— ４４０．１）及管家基因１８Ｓ ｒＤＮＡ（ＧＱ３０２６８０．１）特异性 引物进行ｃＤＮＡ第ｌ链合成。以各基因ｃＤＮＡ第１ 链为模板进行目的片段ＰＣＲ，反应中调整反应循环 数，以１０、１５、２Ｏ个循环每隔５个循环进行一次反 应，ＰＣＲ反应条件为以目的基因条带指数增长期循 环数为准确定基因表达量的差异。各基因ＰＣＲ反 应体系为：２ Ｉ ｃＤＮＡ产物，０．５ Ｌ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合 酶，目的基因（或１８Ｓ ｒＤＮＡ基因）上下游引物各１ Ｌ， ｄＮＴＰｓ １“Ｌ，１０×ｂｕｆｆｅｒ ５ ｔＡ ，ＭｇＣ１２（２５ ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ） ３ Ｉ ，终体积５Ｏ Ｌ。反应程序如下：９４℃２ ｍｉｎ， ９４。Ｃ ５０ ｓ，５８。Ｃ（ｃｄｅｐ１）／５２℃（ｃｈｉｔ１）／５８℃（１８Ｓ ｒＤＮＡ）５０ Ｓ，７２。Ｃ １ ｍｉｎ（１０、１５、２０、２５个循环）， ７２℃１０ ｍｉｎ。４℃保存。 表１待测基因所用引物序列 ｅ出 ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ＧＣＡ（Ｘ３ 玎 Ｏｅ 门 鞠 ｒ．ＡＧ ｃｄｅｐｌ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｃｈｉｔ１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｎ ｒｅｖｅｍｅ ｐｒｉｍｅｒ ＧＧＡＧＧＴＡＡＧＡＧ（Ｙ２ＣＣＡＧＡＴＴＧ￣ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ＣＣＴＣＴＧＧＣｇＥＴＣＣＴＴＧＧＴＧＡＴＴＣ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ＣＡＧＡＣＣＴＴＧＣＣＣ￣ＣＡＡＴＴＧＴＴＣＣＴ ・ ６８ ・ 才直扬铱妁 ２０１２ 根据上述ＰＣＲ反应结果确定各基因扩增指数 期循环数，以供试菌株不同世代各基因ｃＤＮＡ为模 板，进行ＰＣＲ扩增。琼脂糖凝胶电泳胶浓度１．５ 。 ２结果与分析 ２．１继代培养对白僵菌孢子萌发率的影响 两菌株在ＳＤＡＹ培养基中经１６ ｈ培养后，其萌 发率如图１所示。两个菌株的萌发率变化规律基本 相似，Ｆｚ代萌发率明显高于Ｆ 代，分别达到７７ 和 ７Ｏ ，在随后的继代培养中，Ｆ｛、Ｆ４、Ｆ 代萌发率依 次降低，Ｌ１—１的Ｆ 代萌发率仅为２ 。 １ＯＯ 、。 ８Ｏ ０ ４０ 罄２Ｏ Ｏ 图１供试臼僵茵菌株不同世代萌发率测定（ｐ＝０．０５） ２．２继代培养对白僵菌杀玉米螟毒力的影响 白僵菌两菌株不同世代对亚洲玉米螟２龄幼 虫的毒力测定结果见表２和表３。菌株ｕ一１ Ｆ 代 孢子对亚洲玉米螟的致死中时（ＬＴ 。）和致死９Ｏ 时间（ＬＴ９。）分别为１８６．６３ ｈ和２８４．１６ ｈ，而Ｆ２代 孢子分别为１８０。６１ ｈ和２０９．６１ ｈ，明显低于Ｆ１ 代，而Ｆ。～Ｆｓ代孢子的Ｉ Ｔ 。和Ｌ 。逐渐增加，明 显高于Ｆｚ代和Ｆ 代，说明其毒力在不断下降。 Ｄ６—２菌株Ｆ 代孢子对亚洲玉米螟的ＬＴ 。和ＬＴ。。 分别为１７Ｏ．０９ ｈ和１９Ｏ．２１ ｈ，而Ｆ。代分别为 １３７．７０ ｈ和１６５．８４ ｈ，明显低于Ｆ１代，而Ｆ３～Ｆ５ 代孢子的ＬＴｓ。和ＬＴ。。逐渐增加，明显高于Ｆ２代和 Ｆ 代，说明随着继代次数的增加其毒力也在不断 下降。 表２白僵菌Ｌ１－１菌株不同世代对亚洲 玉米螟２龄幼虫的毒力（１Ｏ’孢子／ｍＬ） 世ｌ弋 霉炙 蛆责程 ：：瑟 糯凳系 魂 瞄 鼍譬ｌ鼍 ｈ－ Ｅｔ Ｑ ０４６ ５ｘ 毽 ６７８琏 Ｏ．８４５￣ ８６．６３ ２１４． 鸯。 。２ ０４７ ４ｘ，一蕊 ６０８ ８２８ ４ １８．５Ｉ＿ ６１ ２０８￣６ｉ Ｆａ Ｑ．０４４ Ｏｘ 一３．７ 岛 ９ ０．８９１９｜ Ｉ． 舄 ３８ ２２８．３２ 娶 Ｑ ０３７ ３ｘ。＿一 ２啊９ Ｏ．９ｏｏ琵２ Ｉ 毡０｜ 篷毫 蔼薯 ０．０３９ ∞－－４．３７１ ５ Ｏ．９４１ ８ ２毽鞋｜ 舔誊｜ 鼍 表３ 白僵菌Ｄ６—２菌株不同世代对亚洲玉米 螟２龄幼虫的毒力（１０’孢子／ｍＬ） ２．３继代培养对白僵菌毒力相关基因表达的影响 ２．３．１ ＲＴ－ＰＣＲ反应循环数的确定 利用供试菌株目的基因和管家基因ｃＤＮＡ第１ 链为模板，进行目的基因半定量ＲＴ－ＰＣＲ反应循环 数的确定。从图２中可以看出，１８Ｓ ｒＤＮＡ基因和 ｃｈｉｔ１基因在１５～２Ｏ个循环时条带差异明显，而 ｃｄｅｐｌ基因在１０～１５个循环时条带差异明显，因 此，以１８个循环为１８Ｓ ｒＤＮＡ基因和ｃｈｉｔ１基因的 检测循环数，以１３个循环作为ｃｄｅｐｌ基因的检测循 环数。 ３００ ｂｐ ａ．管家基因ｌ８Ｓ ｒＤＮＡ Ｍ ｌ ２ ３ ４ ｂ ｃｈｉｔｌ基因 Ｍ １ ２ ３ ４ ｃ．ｃｄｅｐＩ基因 Ｍ为分子量ｍａｒｋｅｒ，条带１～４分别为循环数１０、１５、２０、２５ 图２管家基因及毒力相关基因 半定量ＲＴ－ＰＣＲ循环数的确定 ２．３．２ 目的基因的半定量ＲＴ－ＰＣＲ检测 为了明确继代培养对球孢白僵菌毒力相关酶基 因表达情况的影响，以１８Ｓ ｒＤＮＡ基因为内参，利用 半定量ＲＴ－ＰＣＲ对ｃｄｅｐｌ基因和ｃｈｉｔ１基因的表达 情况进行了检测。从图３可以看出，在内参基因稳 定表达，也就是总ＲＮＡ量相同的情况下，两个供试 ３８卷第２期 孙召朋等：白僵菌培养基继代培养对蛋白酶（ｃｄｅｐ１）、几丁质酶（ｃｈｉｔ１）基因表达的影响 ・６９・ 菌株Ｌ１—１和Ｄ６—２的ｃｄｅｐｌ基因和ｃｈｉｔｌ基因在Ｆ１ 规律。Ｆ 与Ｆ。代各项指标基本相似或者略低于Ｆ。 和Ｆ。代表达稳定，随着继代次数的增多，供试菌株 两个基因的ＰＣＲ条带明显变弱，说明其表达量在不 断下降，这与对亚洲玉米螟毒力测试的结果一致。 代，从Ｆ。代开始到Ｆ 代，萌发率、毒力及其相关酶 基因的表达呈现逐渐降低的趋势，这和唐晓庆等人 所报道的继代培养中产生不同类型的分离株，这些 分离株多表现为产孢量下降、毒力降低等与生产性 ｃｄｅｐＩ Ｃ 打Ｉ 状退化类似的变异现象基本相符Ｅ１８］。其可能的原 因是由于Ｆ 刚从沙土管中接出，菌株新陈代谢能力 ｌ８Ｓ ｒＤＮＡ 皇墨薯置田置■薯置圈 下降，经过相当于活化阶段的Ｆ 代后，在Ｆ 代各种 ａ ｂ ａ．菌株ＬＩ一１，ｂ．菌株Ｄ６．２，１～５分别代袁Ｆ ～Ｆ 图３继代培养对球孢白僵菌毒力相关酶基因 ｃｄｅｐｌ和ｃｈｉｔ１基因ｍＲＮＡ表达的影响 ３讨论 毒力测定结果表明，两株白僵菌供试菌株的Ｆ。 代比Ｆ 代对亚洲玉米螟２龄幼虫的毒力有所增强， 而Ｆ。～Ｆ 代对玉米螟的毒力呈下降趋势。球孢白 僵菌通过分泌蛋白酶、几丁质酶和脂酶来降解昆虫 体壁，其中几丁质酶和蛋白酶具有重要作用Ｅ１２－１４］。 本研究利用半定量ＲＴ－ＰＣＲ方法对两株白僵菌中 两种毒力相关酶基因在不同世代的表达情况进行了 测定，发现随着继代次数的增多，供试菌株两个毒力 相关酶基因的表达量均呈下降趋势，与对亚洲玉米 螟毒力测定结果一致。出现这种现象可能是由于 Ｆ 代直接接种于沙土管，菌株并没有表现出很高的 萌发率和毒力，在Ｆ 活化之后，Ｆ 代达到其毒力最 大值，Ｆ。～Ｆ５依次减弱。 在白僵菌继代培养过程中，随着继代次数的增 多，会有多个生物性状发生改变。Ｐ．Ｒａｊａｎｉｋａｎｔｈ 等Ｅ¨］报道继代培养对产孢量和毒力有很大的影响。 唐晓庆等ｌ６ 报道了继代培养中菌落都会发生变化， 并提出了菌落局变发生的几种可能的遗传机制。唐 晓庆等人ＥＭ］报道了继代培养对抗旱力的影响，结果 显示继代培养能增强菌株的抗旱力，但菌株生活力 减弱。樊美珍等ｌｌ ］通过研究证明，以ＳＤＡＹ为基 础培养基的不同Ｃ／Ｎ比、不同ｐＨ培养基中，均未 发现菌落局变及菌种退化，ＳＤＡＹ最适于白僵菌生 长。本试验中采用ＳＤＡＹ为培养基研究供试白僵 菌菌株萌发率、毒力及其相关酶基因的表达，结果表 明这些指标均发生了变化，并且表现出相似的变化 指标都达到最大值，从Ｆ 代到Ｆ 代的继代培养，菌 株毒力相关酶基因表达量逐渐降低，从而导致了毒 力的下降。Ａｎｓａｒｉ等［１９］对另一广泛应用的生防真 菌绿僵菌（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）的３株商业化 菌株进行了１２代的继代培养，发现其毒力并未发生 变化，并将其作为绿僵菌高效菌株的筛选标准。生 防真菌的毒力在继代培养过程中可能依赖其自身的 遗传背景，本研究中只对两株白僵菌菌株进行了继 代培养对毒力及毒力相关因素的影响，是否在白僵 菌中存在经继代培养而毒力不发生变化的菌株，还 需要进一步研究。 由于白僵菌对靶标昆虫的致病力由多种因素 造成Ｅ ，本研究只是从蛋白酶和几丁质酶基因的表 达方面进行了研究，关于其他影响因素如萌发率、 毒素代谢水平等还需进一步研究。同时，在菌种使 用过程中，定期进行虫体复壮，可以恢复菌株毒力 这一问题上存在争论ｌ２ ，本试验只对培养基继代 培养白僵菌毒力退化情况进行了测定，对于通过虫 体进行菌株复壮并未研究，后者可作为以后研究的 新方向。 参考文献 Ｅｌｉ林海萍，韩正敏，张昕，等．球孢白僵菌研究现状及提高其杀虫 效果展望［Ｊ］．浙江林学院学报，２００６，２３（５）：５７５—５８０． Ｅ２３冯明光．胞外蛋白酶和脂酶活性作为球孢白僵菌毒力指标的 可靠性分析＿Ｊ］．微生物学报，１９９８，３８（６）：４６１—４６７． ［３］王清海，万平平，黄玉杰，等．虫生真菌在害虫生物防治中的应 用研究＿Ｊ］．山东科学，２００５，１８（４）：３７—４１． ［４］Ｇｏｅｔｔｅｌ Ｍ Ｓ，Ｈａｊｅｋ Ａ Ｅ，Ｓｉｅｇｅｌ Ｊ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ａｇｅｎｔｓ［Ｍ］ｆ Ｂｕｔｔ Ｍ，Ｊａｃｋｏｎ Ｃ，Ｍａｇａｎ Ｎ．Ｆｕｎｇｉ ａｓ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ａｇｅｎｔｓ，ＣＡＢ 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Ｅｃｏｌｏｇｙ， ｌ９６８，１０（２）：２ｌ０—２１４． ｔｏｒ Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌａ ｓｅｐｔｅｍｐｕｎｃｔａｔａ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１，ｌｌ（１）：９９—１１０． １ｗａｏ Ｓ．Ａ ｎｅｗ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ［１５］ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｌＪ］．Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ｏｎ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｅｃｏｌｏｇｙ，１９６８，１０（１）：ｌ一２Ｏ． ［８］ Ｓｈａｈ Ｐ Ａ，Ａｅｂｉ Ｍ，Ｔｕｏｒ Ｕ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｒｎ ｅｕ— ｐｈｏｒｂｉａｅ ｗｉｔｈ ｍｙｃｅｌｉａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｅｒｙｎｉａ ｎｅｏａｐｈｉｄｉｓ ｉｎ ａ ［１６］ Ｔａｙｌｏｒ Ｉ Ｒ．Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅａｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ， ｌ９６ｌ，１８９（４７６６）：７３２—７３５． ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｔｒｉａｌ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，１０４（６）：６４５ ［１７］ 唐启义，冯明光．实用计算机统计分析及其计算机处理平台 ［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００２． ［１８］ 刘树生，汪信庚，吴晓晶，等．甘蓝和白菜上桃蚜种群的空间格 局及其时序动态［Ｊ］．昆虫学报，１９９６，３９（２）：１５８—１６４． 关雄，高日霞．粉虱座壳孢菌的空间分布型及其抽样技术［Ｊ］． ［１９］ ６５２． ［９］Ｗｉｌｄｉｎｇ Ｎ，Ｍａｒｄｅｌｌ Ｓ Ｋ，Ｂｒｏｂｙｎ Ｐ Ｊ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｒｙｎｉａ ７＂ｌｅｏ ａｐｈｉｄｉｓ ｉｎｔｏ ａ ｆｉｅｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｈｉｓ＿厂“ｂａｅ：ｆｏｒｍ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎ— ｏｃｕｌｕｍ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｌ９９０．１０８（１）１ ３７３—３８５． 福建农学院学报，１９９１，２０（１）：２９—３３．