绿⾊荧光蛋⽩(GFP)基因的克隆和表达背景知识
绿⾊荧光蛋⽩（green fluorescent protein，GFP）是⼀类存在于包括⽔母、⽔螅和珊瑚等腔肠动物体内的⽣物发光蛋⽩。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿⾊荧光。它产⽣荧光⽆需底物或辅因⼦。发⾊团是其蛋⽩质⼀级序列固有的。GFP 由3个外显⼦组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋⽩,相对分⼦质量为27. 0kMr，其蛋⽩性质⼗分稳定，能耐受60℃处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋⽩质中央是⼀个圆柱形⽔桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中⼼α螺旋的反平⾏β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直⽚段覆盖，底部由⼀个短的垂直⽚段覆盖，对荧光活
性很重要的⽣⾊团则位于⼤空腔内。发⾊团是由其蛋⽩质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly⾃⾝环化和氧化形成.实验⼀质粒DNA的分离与纯化⼀、实验⽬的
掌握⼀种最常⽤的质粒DNA提取⽅法：碱裂解法。该法⽤于从⼩量培养物中抽提质粒DNA，⽐较⽅便、省时，提取的质粒DNA质量较⾼，可⽤于DNA的酶切、PCR甚⾄测序。⼆、基本原理
质粒是⼀类在细菌细胞内发现的独⽴于染⾊体外，能够⾃主复制的稳定的遗传单位。迄今为⽌，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分⼦，分⼦量范围从1kb到200kb。质粒DNA 可持续稳定地处于染⾊体外的游离状态，但在⼀定条件下⼜会可逆地整合到寄主染⾊体上，随着染⾊体的复制⽽复制，并通过细胞分裂传递到后代。在⼤多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染⾊体复制时所⽤的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作⽤的严格限制，因此每个细胞中只含⼀个或⼏个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数⽬可达10-200个拷贝。当宿主细胞的蛋⽩质合成受到
抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染⾊体虽不再增加，但松弛型质粒DNA可继续被复制，以⾄每个细胞内的拷贝数可以增⾄⼀千到⼏千。
质粒具有⼀定的⽣物功能，它们往往带有⼀些抗药标记，当质粒DNA⽤⼈为的⽅法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的⽣物表现型，例如，把⼀个含有抗药基因的质粒转⼊细菌后，原来⽆抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转⼊宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。
质粒作为基因克隆载体分⼦的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分⼦。⽬前已有许多⽅法可⽤于质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的⽣长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的分离；质粒DNA的纯化。1、细菌的⽣长和质粒的扩增
从琼脂培养基平板上挑取⼀个单菌落，接种到含适当抗⽣素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒（如pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中⽣长到对数晚期，就可以⼤量提取质粒，⽽不必选择性地扩增质粒DNA。但对于严
谨型质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分⽣长的细菌培养物中加⼊氯霉素继续培养若⼲⼩时，以便对质粒进⾏选择性扩增。
2、菌体的收集、裂解和质粒DNA的分离
质粒分离的基本原理是利⽤宿主菌（⼀般是⼤肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：（1）⼤肠杆菌的染⾊体较⼀般的载体质粒DNA⼤得多。（2）从细胞中提取得到的⼤肠杆菌DNA主体是变性的线性分⼦，⽽⼤多数质粒DNA是共价闭合的环状分⼦。这⾥主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加⼊SDS（⼗⼆烷基硫酸钠）和NaOH使菌体裂解（有时需要先使⽤溶菌酶⽔解细胞壁）。此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染⾊体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态⽽不能彼此分开。当条件恢复正常时（如加⼊酸性的NaAc或Kac中和碱性NaOH），质粒DNA链迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分⼦。通过离⼼，可以使染⾊体DNA与变性蛋⽩质、RNA分⼦⼀起沉淀下来，⽽质粒超螺旋分⼦仍滞留于上清中。3、质粒DNA的提纯
对于⼩量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋⽩质及RNA，达到纯化的⽬的。质粒DNA分⼦具有三种构型：共价闭合环形DNA（cccDNA，SC构型）、开环DNA（OC构型）和线性分⼦（L构型）。在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同⼀种质粒DNA，尽管分⼦量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中⾛在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。
三、实验材料、仪器及试剂
1. 在含有pEGFP－N3质粒的DH5α平板上菌落上挑取菌种，置于含有5mL LB培养基的试管中。
摇晃过夜。（DH5α是⼀种⼤肠杆菌的诱变菌株，主要表现对外源DNA的免疫缺乏，是⽤于基因⼯程的菌种）在含有pET-28a质粒的平板上挑取单菌落于另外⼀个试管中，同样摇荡培养过夜。2、使⽤仪器
恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离⼼机，⼩型混合器，冰箱四、实验步骤
1.取1.5ml DH5α培养液倒⼊1.5mL eppendorf 管（⼀种离⼼管）中, 13000rpm离⼼1min。2.重复1。
3.弃上清,将管倒置于卫⽣纸上数分钟,使液体流尽。
4.菌体沉淀重悬浮于100µL溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置10min。
（溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液I的作⽤；mM为mmol/L。任何⽣物化学反应，⾸先要控制好溶液的pH，因此⽤适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最⼤的好处是悬浮后的⼤肠杆菌不会快速沉积
到管⼦的底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等⼆价⾦属离⼦的螯合剂，配在分⼦⽣物学试剂中的主要作⽤是：抑制DNase的活性，和抑制微⽣物⽣长。在溶液I中加⼊⾼达 10 mM 的EDTA，⽆⾮就是要把⼤肠杆菌细胞中的所有⼆价⾦属离⼦都螯合掉。菌体⼀定要悬浮均匀，不能有结块。）
5.加⼊新配制的溶液Ⅱ200µl, 盖紧管⼝，快速温和颠倒eppendorf 管5次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5min。
（溶液II，0.2 M NaOH / 1% SDS；溶液II的作⽤；这是⽤新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使⽤的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，保证NaOH没有吸收空⽓中的CO2⽽减弱碱性。其实破细胞的主要是碱，⽽不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是⼤肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会⼏乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发⽣了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。⽤了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也⽆法有效溶解⼤肠杆菌（不妨可以⾃⼰试⼀下），⾃然就难⾼效率抽提得到质粒。这⼀步要记住两点：第⼀，时间不能过长，因为碱性条件下基因组DNA⽚断会慢慢断裂；第⼆，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。）6.加⼊150µL预冷的溶液Ⅲ,盖紧管⼝，并倒置离⼼管，温和振荡3次,使沉淀混匀,冰浴中15分钟,13000rpm离⼼5min。
（溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。溶液Ⅲ含3M 醋酸钾 / 2M 醋酸。溶液III加⼊后就会有⼤量的沉淀，这其实是SDS遇到钾离⼦后变成了⼗⼆烷基硫酸钾（PDS），⽽PDS是⽔不溶的，因此发⽣了沉淀。⽽⾼浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS易与蛋⽩质结合，平均两个氨基酸上结合⼀个SDS分⼦，钾钠离⼦置换所产⽣的⼤量沉淀⾃然就将绝⼤部分蛋⽩质沉淀。⼤肠杆菌的基因组DNA也会⼀起被共沉淀，因为基因组DNA太长，容易被PDS共沉淀，注意SDS并不与DNA分⼦结合。
2M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA⼀旦发⽣断裂，只要是50－100 kb⼤⼩的⽚断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，⽽且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有⼤量的基因组DNA混⼊，琼脂糖电泳可以观察到⼀条浓浓的总DNA条带。很多⼈误认为是溶液III加⼊后基因组DNA⽆法快速复性就被沉淀了，这是天⼤的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分⼦在中性溶液中都是溶解的。NaOH 本来是为了溶解细胞⽽⽤的，DNA分⼦的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液III加⼊并混合均匀后在冰上放置，⽬的是为了PDS沉淀更充分⼀点。）
7.上清液移⼊⼲净eppendorf 管中,加⼊等体积的氯仿/异戊醇(24：1),振荡混匀, 13000rpm离⼼2min。
（PDS沉淀的形成后有些蛋⽩质不能被沉淀，因此要⽤酚/氯仿/异戊醇进⾏抽提，然后进⾏酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间⼀长就会因为混⼊的DNase⽽发⽣降解。这⾥⽤25：24：1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的。酚（Phenol）对蛋⽩质的变性作⽤远⼤于氯仿，但是⽔饱和酚的⽐重略⽐⽔重，碰到⾼浓度的盐溶液（⽐如4M的异硫氰酸胍），离⼼后酚相会跑到上层，不利于含质粒的⽔相的回收；加⼊氯仿后可以增加⽐重，使得酚/氯仿始终在下层，⽅便⽔相的回收；还有⼀点，酚与⽔有很⼤的互溶性，如果单独⽤酚抽提后会有⼤量的酚溶解到⽔相中，⽽酚会抑制很多酶反应（⽐如限制性酶切反应），⽽⽤酚/氯仿的混合液进⾏抽提，跑到⽔相中的酚则少得多，微量的酚在⼄醇沉淀时就会被除⼲净⽽不必担⼼酶切等反应不能正常进⾏。⾄于异戊醇的添加，其作⽤主要是为了让离⼼后上下层的界⾯更加清晰，也⽅便了⽔相的回收。）8.将⽔相移⼊⼲净eppendorf 管中,加⼊等体积的氯仿/异戊醇(24：1)振荡混匀, 13000rpm离⼼2min。
9.将⽔相移⼊⼲净eppendorf 管中,加⼊2 倍体积的⽆⽔⼄醇,振荡混匀后，置于室温下2min，然后13000rpm离⼼5min。
（回收后的⽔相含有⾜够多的盐，因此只要加⼊2倍体积的⼄醇，在室温放置⼏分钟后离⼼就可以将质粒DNA沉淀出来。）10.弃上清,将管⼝敞开倒置于卫⽣纸上使所有液体流出,加⼊1mL 70％⼄醇洗沉淀⼀次, 振荡混匀后，13000rpm离⼼5min。
（⾼浓度的盐会⽔合⼤量的⽔分⼦，因此DNA分⼦之间就容易形成氢键⽽发⽣沉淀。如果感觉发⽣了盐的沉淀，就⽤70％的⼄醇多洗⼏次，每次在室温放置⼀个⼩时以上，并⽤移液枪枪头（tip）将沉淀打碎，就能得到好的样品。）11.吸除上清液,将管倒置于卫⽣纸上使液体流尽,室温⼲燥。
12.将沉淀溶于30µL TE缓冲液(pH8.0，含20µg/mL RNaseA)中，保存在-20℃冰箱中。（溶解已经讲解的RNA，防⽌未降解的RNA会⼲扰电泳结果。）
13.按照同样的流程和⽅法将pET-28a的质粒也提出来，保存在-20℃冰箱中。
五、实验结果
实验⼆质粒DNA浓度的测定⼀、实验⽬的
学习利⽤核酸蛋⽩测定仪测算核酸的浓度和纯度。⼆、基本原理
核酸分⼦在260nm下有最⼤吸光值，因此可以通过260nm下核酸的吸光值计算核酸浓度（mg/ml），并通过测定与280nm和230nm的⽐值，估算DNA的纯度。
（除了核酸浓度,分光光度计同时显⽰⼏个⾮常重要的⽐值表⽰样品的纯度,如 A 260 / A 280
的⽐值,⽤于评估样品的纯度，因为蛋⽩的吸收峰是 280 nm.纯净的样品,⽐值⼤于 1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果⽐值低于 1.8 或者 2.0，表⽰存在蛋⽩质或者酚类物质的影响。A 230表⽰样品中存在⼀些污染物，如碳⽔化合物,多肽,苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的⽐值⼤于 2.0。A 320检测溶液的混浊度和其他⼲扰因⼦。纯样品，A 320 ⼀般是 0。）三、实验材料与仪器1、实验材料
pEGFP－N3和pET-28a DNA2.使⽤仪器
Eppendorf核酸蛋⽩测定仪，移液枪四、实验步骤
1.按下Eppendorf核酸蛋⽩测定仪100µl ddH2O
2.取⼀0.5ml离⼼管，吸取质粒DNA 5µl，然后再加⼊95µl ddH2O，混匀。3.将100µl的溶液转移到⽐⾊⽫中，注意不要出现⽓泡。
4.记录260nm下DNA的浓度（mg/ml）。并同时记录OD260nm/280nm，OD260nm/230nm的⽐值，估测DNA的纯度。
5.计算质粒DNA母液的浓度=OD260nm下的浓度×20（mg/ml），
DNA的纯度：OD260nm/280nm=1.8±0.1(如果低于1.7，说明样品中蛋⽩质去除的不完全，或样品中有苯酚的污染；如果⾼于1.9，说明样品中RNA去除的不完全。) 正常OD260nm/230nm约为2.5，OD260nm/230nm ⼩于2.0，表⽰样品中存在⼀些污染物，如碳⽔化合物,多肽,苯酚等盐和⼩分⼦。实验三琼脂糖凝胶电泳⼀、实验⽬的
学习掌握⼀种最常⽤的分离、鉴定、纯化DNA⽚段的⽐较⽅便、省时的技术：琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作⽅法。⼆、基本原理
影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：（1）DNA分⼦的⼤⼩双链DNA分⼦在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常⽤对数成反⽐。分⼦越⼤，迁移的越慢，因为摩擦阻⼒越⼤，也因为⼤分⼦通过凝胶孔径的效率低于较⼩的分⼦。（2）琼脂糖浓度给定⼤⼩的线状DNA⽚段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度之间存在线性相关。（3）DNA的构象超螺旋环状（Ⅰ型）、切⼝环状（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型）DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，其次是电流强度、缓冲液离⼦强度和Ⅰ型超螺旋绞紧的程度或密度。⼀些条件下，Ⅰ型DNA⽐Ⅲ型迁移得快；在另⼀些条件下，顺序可能相反。（4）所⽤的电压低电压时，DNA⽚段迁移率与所⽤的电压成正⽐。电场强度升⾼时，⾼分⼦量⽚段的迁移率遂不成⽐例的增加。所以，当电压增⼤时琼脂糖凝胶分离的有效范围反⽽减⼩。要获得⼤于2kb DNA⽚段的良好分辨率，所⽤电压不应⾼于5-8V/cm。（5）电泳缓冲液 DNA的泳动受电泳缓冲液的组成和离⼦强度的影响。缺乏离⼦则电导率降低，DNA或者不动或者迁移很慢。⾼离⼦强度时（如10×buffer），电导率升⾼，使得应⽤适中的电压也会产⽣⼤量的热能，最严重时凝胶会熔化，DNA变性。三、实验材料、仪器及试剂1、实验材料质粒DNA2、使⽤仪器
核酸电泳仪，⼩型混合器，冰箱，蓝盾可见光透射仪四、实验步骤
1、1%琼脂糖凝胶的配制
（1）加20ml 1×TBE缓冲液于三⾓瓶中。
（TBE缓冲液为Tris硼酸-EDTA缓冲溶液，适合长时间电泳，但测得分⼦质量⼤于实际分⼦质量，；TAE缓冲液为Tris醋酸-EDTA缓冲溶液，运⽤最⼴泛，较准确但不适合长时间；
TPE缓冲液为Tris磷酸-EDTA缓冲溶液，磷酸盐易在⼄醇沉淀过程中析出，不适合DNA回收。）
（2）精确称取0.2g琼脂糖加到三⾓瓶中，于微波炉中加热⾄完全熔化，（3）冷却⾄60℃左右，
（4）轻缓倒⼊封好两端和加上梳⼦的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上，
（5）将胶板除去封胶带，放⼊电泳缓冲液（TBE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm，轻轻拔除梳⼦，（6）取5µl质粒DNA及2µl Genefinder混匀上样。（也可使⽤GelRed荧光核酸凝胶染⾊试剂，⽤凝胶成像仪显影）（7）50-100v约电泳0.5-1⼩时。（8）蓝盾可见光透射仪观察结果。五、实验结果
实验四酶切及连接1.实验⽬的
学习使⽤限制型内切酶进⾏DNA酶切的原理和⽅法。2. 实验原理
迄今已发现了3000多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因⼦等因素划分为三⼤类。II 型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA 链。它们产⽣确定的限制⽚段，因此是三类限制性内切酶中唯⼀⽤于DNA 分析和克隆的⼀类。
II 型限制性内切酶中最普遍的是象EcoR I 、Hind III 、BamHI 和Not I 这样在识别序列中进⾏切割的酶。这⼀类酶是构成商业化酶的主要部分。⼤部分这类酶都以同⼆聚体的形式结合到DNA 上，因⽽识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA 上，识别⾮对称序列。⼀些酶识别连续的序列（如EcoR I 识别GAATTC ；Hind III 识别AAGCTT;BamHI 识别G
↓GATCC; Not I 识别GC ↓GGCCGC ）；⽽另⼀些识别不连续的序列（如Bgl I 识别GCCNNNNNGGC ）。限制性内切酶酶切DNA 后形成两种类型的末端：(i)两条链断裂的位置是交错地，产⽣粘性末端，如EcoR I 酶切后产⽣末端；(ii)两条链的断裂位置处在⼀个对称结构的中⼼，产⽣平末端，如HaeIII 酶切后产⽣
DNA 连接酶能够催化在两条DNA 链之间形成磷酸⼆酯键，这种酶需要在⼀条DNA 链的3’-末端具有⼀个游离的羟基（-OH），和在另⼀条DNA 链的5’-末端具有⼀个磷酸基团（-P ）。
3. 实验材料、仪器及试剂 3.1 实验材料pEGFP －N3和pET-28a DNA5’-G ↓AATTC-3’ 3’-CTTAA ↓G-5’5’-GG ↓CC-3’3’-CC ↓GG-5’。
5’ 3’5’3’
3.2 仪器准备
⽔浴锅、移液器、电泳槽、电泳仪、振荡器、制冰机、蓝盾可见光透射仪、凝胶成像仪3.3 试剂BamH I(10U/µL) (TaKaRa公司); Not I(10U/µL) (TaKaRa公司),T4 ligase4. 操作步骤4.1 酶切
按如下双酶切体系（30µL）混合：反应物（µL）pEGFP-N3 pET-28a质粒18 18BamH I 2 2Not I 2 210×buffer K 3 30.1%BSA缓冲液 3 3
（BSA缓冲液为⽜⾎清⽩蛋⽩，稳定酶的活性。）1.离⼼10s，混匀。2.37℃⽔浴酶切3-4h。
3.配制1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶30ml。
（1%（m/v）指：⼀般是固体溶于液体的，1g固体溶于100mL⽔中。）4.适当放置冷却，45℃左右倒于电泳胶板上，插好梳⼦。5.待凝胶凝固好以后，拨下梳⼦。
6.酶切样品中加⼊5µl溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀，上样。7.1×TBE Buffer，80V(3-4V/cm)下电泳30min。8.荧光激发器观察质粒DNA条带的酶切情况，并照像。4.2 回收酶切产物（采⽤天为时代DNA回收试剂盒进⾏回收）
1)配30mL 1％进⼝琼脂糖凝胶，尽量长⼀些（⽤粗梳⼦），对酶切产物进⾏电泳分离；2)将酶切产物全部加⼊加样孔中3)跑胶，观察结果，并且拍照。
4)⽤⼲净的⼑⽚将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取重量。5)以0.1g凝胶对应300µL的体积加⼊PN（溶胶液）。
6)50℃⽔浴放置10min，期间不断温和上下翻动离⼼管⾄胶完全融解。
7)将上⼀步得到的溶液加⼊到⼀个吸附柱中，吸附柱再放⼊收集管，13000rpm离⼼60s，弃掉废液。
（吸附柱，⽤于吸附层析）
8)加⼊800µL漂洗液PW，13000rpm离⼼60s，弃掉废液。（PW是去盐的洗脱液，⽬的是洗脱脂类、蛋⽩及盐类等杂质）9)加⼊500µL漂洗液PW，13000rpm离⼼60s，弃掉废液。10)将离⼼吸附柱放回收集管，13000rpm离⼼2min。
11)取出吸附柱，放⼊⼀个⼲净的离⼼管中，在吸附膜的中间位置加⼊适量洗脱缓冲液EB30µL，洗脱缓冲液先在65℃⽔浴预热，室温放置2min，13000rpm离⼼1min，然后将离⼼的溶液重新加回离⼼吸附柱中，13000rpm离⼼1min。12)置于－20℃保存。4.3 连接
按照连接体系进⾏，16℃连接过夜。反应物体积/µL
回收纯化的pET-28a质粒 5gfp基因⽚段12T4连接酶 1缓冲液（10×） 2
实验五⼤肠杆菌感受态细胞的制备及转化⼀、实验⽬的
了解和掌握⼤肠杆菌感受态细胞的制备⽅法的原理和操作要点，以及质粒DNA转化⼤肠杆菌细胞的原理和⽅法。⼆、基本原理
外源DNA只有转化到⼤肠杆菌细胞内才能得到扩增。感受态指细菌细胞具有的能够接受外源DNA的⼀种特殊⽣理状态。⼤肠杆菌的感受态可⽤CaCl2处理⽽诱导产⽣：将正在⽣长的⼤肠杆菌细胞在0℃下加⼊到低渗的CaCl2溶液中，便会使细胞膜的透性发⽣改变，此时的细胞即呈现为感受态。这⼀⽅法可以⽤于批量制备感受态细胞，其转化效率可达到5×106-2×107个转化克隆⼦/µg超螺旋质粒DNA。制备好的⼤肠杆菌感受态细胞可在-70℃冻存。
在0℃下外源DNA可吸附到感受态细胞表⾯，短时间的热刺激（42℃，90s）诱导细胞吸收DNA。(Ca2+会使细胞膜磷脂双分⼦层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。将该体系热激，细胞膜的液晶结构会发⽣剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进⼊细胞的外源DNA分⼦通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。)
转化了质粒DNA的⼤肠杆菌随后在培养基中37℃培养1hr，可使质粒DNA中编码抗⽣素抗性的基因得以表达，因此，转化了质粒DNA的⼤肠杆菌细胞可在含有相应抗⽣素的培养基上⽣长，⽽没有转化的细胞则⽆法⽣长。三. 实验材料、仪器
1. 实验材料
DH5α，BL21，pET-28a重组质粒DNA2.使⽤仪器
⽔浴锅，⾼压灭菌锅、移液器、超净⼯作台、离⼼机、振荡培养箱，制冰机四、操作步骤
1. LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）
氨苄青霉素和卡那霉素等抗⽣素不抗热，如果培养基温度过⾼，容易导致抗⽣素失效，应使培养基降温⾄60℃左右后，再加⼊抗⽣素。但也不应使培养基的温度过低，否则容易出现⽓泡。75mm直径的培养⽫约需15ml培养基。2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)
（1）挑⼀⼤肠杆菌单菌落放⼊3ml LB液体培养基（含Kan+），37℃培养过夜。
（2）活化⼤肠杆菌：取3ml新鲜的LB液体培养基加⼊50-150µl的过夜菌，培养2-3个⼩时。（3）将昨夜摇出来的DH5α或BL21培养液转⼊离⼼管中,冰上放置10min,然后于4℃下4000rpm离⼼5min。
（4）弃去上清,⽤预冷的0.1mol/L 的CaCl2溶液600µL轻轻悬浮细胞,冰上放置20min, 4℃下4000rpm离⼼5min。
（5）弃去上清,加⼊300µL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置5min,即成感受态细胞悬液，可-80℃长期保存。3. 转化涂板
（1）取2个⽆菌离⼼管，分别加⼊100µL DH5α感受态细胞悬液，第1管加5µl⽆菌⽔，第2管加⼊质粒DNA溶液5µl,轻轻摇匀,冰上放置30min。
（2）42℃⽔浴中热激90s,热激后迅速置于冰上冷却5min。
（3）分别向管中加⼊100µL LB液体培养基,混匀后在37℃振荡培养30min。
（4）从管1中取50µL涂布于含抗⽣素和不含抗⽣素的平板上,从管2中取50µL和100µL涂布于含抗⽣素的平板上。正⾯向上放置约10分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养⽫,37℃培养20⼩时。
（50µL 和100µL 构成浓度梯度，便于后续筛选菌落密度合适的平板）实验六 重组质粒DNA 的鉴定（双酶切法和菌落PCR 法）⼀、实验⽬的
掌握双酶切法鉴定重组质粒DNA 的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR 法鉴定重组质粒DNA 的基本原理。了解菌落PCR 法鉴定菌落及保存的操作⽅法。 ⼆、基本原理
重组质粒DNA 是利⽤限制性内切酶（如BamH I 和Not I ）分别酶切基因⽚段和质粒后，利⽤基因⽚段和质粒DNA ⼀端带有相同的粘性末端连接起来的重组质粒，如果再利⽤相同的限制性内切酶识别重组基因⽚段两侧的酶切位点，通过酶切下的重组⽚段的⼤⼩与连接的基因⽚段⼤⼩是否相同判断质粒DNA 是否为重组质粒。
单菌落或提取的质粒DNA 也可以通过PCR ⽅法鉴定正确克隆。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA ⽚段的⼀种⽅法。典型的PCR 由⾼温变性、低温退⽕和适温延伸等三步反应组成⼀个循环周期，通过多次循环反应，使⽬的DNA 得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的DNA 置于⾼温下使之解链，⼈⼯合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别在⽬的⽚段两侧与DNA 两条链互补结合；DNA 聚合酶在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺⼊，沿模板从5’→3’⽅向延伸，合成DNA 的新互补链。
具体地说，PCR 反应系统有寡核苷酸引物，反应缓冲液，热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶），脱氧核苷三磷酸底物和靶序列（即模板）等五部分组成，缺⼀不可。
管1 管1 管2 管2 50µL 50µL 50µL 100µL
PCR技术能在试管中建⽴反应，经数⼩时之后，就能将极微量的某⼀特定的⽬的DNA⽚段扩增106倍以上，⽽⽆需经过烦琐的基因克隆程序便可获得⾜够数量的精确的DNA拷贝。它操作简单，易于掌握，结果也较为可靠，为基因的分析和研究提供了⼀种强有⼒的⼿段，对整个⽣命科学的研究与发展都有深远的影响。因此，PCR技术产⽣的时间虽不长，却以惊⼈的速度⼴泛地应⽤于分⼦⽣物学的各个领域。它可⽤于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析、突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及法医鉴定等诸多⽅⾯。三、实验材料、仪器及试剂1. 实验材料
pET-28a重组质粒DNA或菌落2. 使⽤仪器
PCR仪，掌中宝离⼼机，冰箱，⼩型混合器，电泳槽和电泳仪，1.5ml离⼼管，移液器及吸头，蓝盾可见光透射仪，恒温培养箱3. 试剂
BamH I(10U/µL) (TaKaRa公司); Not I(10U/µL) (TaKaRa公司)四、实验步骤1.双酶切法
（1）随机挑取2个单菌落，接种，37℃振荡培养过夜。（2）质粒DNA的提取（碱裂解法）。（3）双酶切鉴定体系(10µl)。反应物(µl) 管1 管2质粒DNA 2 2BamH I 0.5 0.5Xho I 0.5 0.510×buffer K 1 1ddH2O/µl 6 6
（4）室温酶切2.5-3h。
（5）配制1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶20ml。
（6）酶切样品中加⼊5µl溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀，上样。
（7）1×TBE Buffer，80V(3-4V/cm)下电泳30min。
（8）荧光激发器观察质粒DNA条带的酶切情况，并照像。并确定最终的阳性克隆2.菌落PCR法（1）挑取菌落
随机挑取5个菌落。⾸先使⽤⽆菌枪头挑取菌落，在已准备好的含有卡那抗菌素，分好区的固体培养基中轻划⼀下（为保菌种），然后将余下菌置于eppendorf管中（作为PCR反应模板）。（2）PCR反应体系（20µl）反应物体积/dNTP（10mM） 2左引物0.5右引物0.5
Taq酶（5U/µL）0.5MgCl2(25mM) 1.210×Buffer 2ddH2O 13.3（3）PCR循环：95℃ 5min予变性
（95℃ 60s；58℃ 60s；72℃ 90s）30cycles72℃ 10min延伸（4）PCR产物的检测
PCR产物加⼊5µl溴酚蓝-GeneFinder混合液，分别按编号加⼊DNA琼脂糖凝胶电泳的加样孔，使⽤1%琼脂糖电泳分离。（5）⽤荧光激发器看结果，确定阳性克隆的位置。五、实验结果
实验七 GFP蛋⽩的诱导表达⼀、实验⽬的
掌握⽤IPTG诱导GFP基因表达的基本原理及基本操作步骤。⼆、实验原理
IPTG（异丙基硫代β-L半乳糖苷）是⼀种常见的诱导基因表达的诱导剂，结构类似乳糖。
GFP基因连接到pET-28a的多克隆位点（MCS），GFP基因的表达受其上游T7启动⼦和操纵基因O位点以及结合到这些顺式作⽤元件的蛋⽩因⼦的控制。LacI基因编码调节蛋⽩，可以四聚体的形式结合到操纵基因O位点上，关闭GFP基因的表达。IPTG可与四聚体调节蛋⽩结合，从⽽改
变调节蛋⽩的构象，使调节蛋⽩不再与O位点结合。接着BL21编码的T7 RNA聚合酶结合到T7启动⼦位点，从⽽启动GFP基因的表达。
三、实验材料和仪器1.实验材料
BL21，pET-28a重组质粒DNA2.使⽤仪器
离⼼机，冰箱，⼩型混合器，移液器，恒温培养箱，⼿持式紫外灯，超净⼯作台。四、实验步骤
1.取阳性克隆质粒DNA转化BL21；
2.在含有Kan＋的固体培养基上，37℃培养20h；3.挑取单菌落，37℃振荡培养过夜；
4.取4⽀⽆菌带盖试管，加⼊新鲜LB液体培养基（含有Kan＋）5ml，按1：20稀释⽐例加⼊过夜菌，37℃培养⾄⽣长期,约2-3⼩时。
5.加⼊IPTG（1：1000）⾄终浓度1mmol/L，分别诱导0h，1h，2h，4h。
6.分别取1.5ml，10000rpm离⼼5min，去除上清，收集沉淀，再重复⼀次收集沉淀。7.分别取IPTG诱导培养液20µl涂布在含Kan＋的固体培养基上，37℃培养20⼩时。8.观察蛋⽩表达
⽤紫外线照射菌体沉淀及培养平板，可以看到绿⾊荧光。分别对均匀涂布的平板以及表达蛋⽩的样品管照相，保存照⽚。
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