南京中医药大学学报２０１０年３月第２６卷第２期 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦＮＡＮＪＩＮＧ ＴＣＭ￣Ｎ１ＶＥＲＳ１ＴＹ Ｚ．２６ ２ Ｍａｒ．２（】１Ｏ 一１３７一 茅苍术内生真菌生物多样性与生态分布研究 曹益鸣 ，陶金华 ，江曙 ，郑建兵 （ 江苏省昆山市中医院药剂科，江苏昆山２１５３００； 南京中医药大学药学院，江苏南京２１００４６） 摘要：目的术。结果研究茅苍术不同生长期、不同组织部位内生真菌种群结构与生态分布。方法采用微生物学研究方法与技 茅苍术内生真菌具有丰富的生物多样性，共分离到１２属９６株，其中镰孢属（Ｆｕｓａｆｉｕｍ）、青霉属（ＰｅｎｉｃｉＨｉｕｍ）、 丝核茵属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）和多腔菌属（Ｍｙｆｉａｎｇｉｕｍ）为优势种群。茅苍术内生真菌具有明显的组织专一性，以根茎和叶片中分 布最多，分别是分离菌株总数的６２．５％和２５．０％。此外，内生真菌随着茅苍术生长期不同而出现动态变化，在苗期和花 期内生真菌种群丰富，数量较多，分别是分离菌株总数的３９．６％和３６．５％。结论 四种优势种群在茅苍术各个生长期都 有分布，但均以苗期和花期分布最广泛。 关键词：茅苍术；内生真菌；生物多样性；生态分布 中图号：Ｒ２８２．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００—５００５（２０１０）０２—０１３７—０３ 茅苍术Ａｔｒａｅｔｙｌｏｄｅｓ ｌａｎｅｅａ（Ｔｈｕｎｂ．）ＤＣ．是菊 科苍术属植物，以干燥根茎入药，江苏茅山地区是 其优质道地产区。茅苍术在临床上主要应用于泄 泻、风湿痹痛、风寒感冒、夜盲等病症的治疗…１。 １．２方法 １．２．１内生真菌的分离 采集茅苍术新鲜植株外植体（根、茎、叶等）， 用自来水反复冲洗后，切割成小段，按下列程序进 现代研究表明，茅苍术含有挥发油、糖苷等活性成 分，具有免疫调节、抗肿瘤等多种生物活性＿２』。目 前国内外对于茅苍术品质的研究主要集中于化学 成分、药理药效分析等方面，而忽视了茅苍术植物 体内环境的作用，特别是内生真菌的作用Ｅ ３ｌ。本 文通过研究茅苍术内生真菌的种群结构与生态分 布，以期从内生真菌角度进行茅苍术优良品质形 成机理的有益探索，并为茅苍术的持续利用建立 新的研究思路与方法。 １材料与方法 行表面消毒：０．１％升汞消毒５～８ ｍｉｎ，无菌水冲 洗３次后，再用７５％酒精消毒２０ Ｓ，无菌水冲洗３ 次后，将消毒后的外植体剪切成０．３ ０．５ ｃｍ小 片，接种于ＰＤＡ平皿上，２８％培养８—１０ ｄ，待样品 边缘有菌丝长出，切取组织块边缘菌丝进行培养。 １．２．２内生真菌的鉴定 采用插片培养和点植法，对分离获得的茅苍 术内生真菌进行观察、分类鉴定ｌ５ Ｊ。 １．２．３统计分析 选取茅苍术不同部位的组织块各２００个，进 行内生真菌的分离、鉴定和统计分析，并按照以下 １．１材料 １．１．１茅苍术新鲜植株 方法计算分离率和分离频率ｌ６ 。 分离率（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒａｔｅ，ＩＲ）：是指某一类型内 生真菌菌株数占分离样品总数的百分比。 分离频率（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，ＩＦ）：是指某一 茅苍术采自江苏茅山地区，经南京中医药大 学药学院陈建伟教授鉴定为菊科植物茅苍术４一 ｔｒａｅｏ，ｌｏｄｅｓ ｌａｎｅｅａ（Ｔｈｕｎｂ．）的新鲜植株。 １．１．２培养基 ＰＤＡ培养基ｌ 。 收稿日期：２００９～１０—１６；修稿日期：２００９—１１—１０ 类型内生真菌的菌株数占分离得到的总内生真菌 菌株数的百分率，用来判断该类型真菌是否为植 基金项目：江苏省高校自然科学基础研究项目（０７ＫＪＤ３６０１６４）；江苏省中医药局基金资助项目（ＨＬ０７０７６） 作者简介：曹益鸣（１９７３一），男，江苏昆山人，江苏省昆山市中医院主管中药师。＊通信作者：ｚｚＺ—ｃａｏ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 一ｌ３８一 南京中医药大学学报２０１０年３月第２６卷第 物内生真菌的优势菌群。 ８科，ｌ２属。茅苍术内生真菌的种群组成在属的 ２结果与分析 分类水平上以镰孢属、青霉属、丝核菌属和多腔菌 ２．１茅苍术内生真菌的种群构成 属为优势种群，分别占总菌株数的１２．５％、 从茅苍术植株中分离获得内生真菌９６株，经 １２．５％、１８．８％和２７．１％（表１）。 菌落形态、显微形态观察，鉴定为３纲，５目，１群， 表１茅苍术内生真菌的种群组成 ２．２茅苍术不同部位内生真菌种群分析 片中分离得到，而地霉属仅存在于根部（表２）。 茅苍术植物根、根茎、茎以及叶片等４个组织 ２．３茅苍术不同生长期内生真菌种群的动态变 部位内生真菌在数量、种群分布以及优势种群等 化 方面都存在较大差异，尤其是根茎和叶片中的内 在茅苍术不同生长期，进行取样、分离和鉴 生真菌在种类与数量上较为丰富。茅苍术根茎中 定，结果表明，茅苍术内生真菌种群出现动态变 分布９属６０株内生真菌，叶片中分布５属２４株 化，具有明显的生长季节性。幼苗期和果熟期内 内生真菌，分别是分离菌株总数的６２．５％和 生真菌种群分布较少；苗期和花期内生真菌种群 ２５．０％。优势种群在各个部位的分布也存在一定 丰富，数量较多，在苗期分离到１１属３８株以及在 的差异，如在根茎中优势种群主要是镰孢属、青霉 花期分离到９属３５株内生真菌，分别是分离菌株 属、丝核菌属和多腔菌属，而在叶片中青霉属的种 总数的３９．６％和３６．５％。此外，优势种群组成及 群优势极为显著。多腔菌属在根茎和叶片中分布 数量在各个生长期也具有明显差异，幼苗期和果 较为普遍，分离率高达２０％以上，青霉属、丝核菌 熟期为丝核菌属和多腔菌属，而苗期和花期则为 属集中分布于根茎中，镰孢属在根茎和叶片中分 镰孢属、青霉属、丝核菌属和多腔菌属。虽然四种 布相近。此外，部分内生真菌种群还存在明显的 优势种群在茅苍术的各个生长时期都有分布，但 组织特异性，如束梗霉属、弯孢霉属、又丝白粉菌 分布不均衡，均以苗期和花期分布最广泛（表３）。 属以及节壶菌属仅分布于根茎中，曲霉属只在叶 表２茅苍术不同组织部位内生真菌种群的分布 蕉堕！笠；蔓荃 生真菌生物多样性与生态分布研究第２ ～ｌ３９— 表３茅苍术不同生长期内生真菌种群的动态变化 ３讨论 因此通过对茅苍术内生真菌种群生物多样性与生 植物内生真菌具有丰富的生物多样性，是植 态分布的研究，以内生真菌与茅苍术所构成的微 物体内环境重要的组成部分，与植物在长期共进 生态系统作为研究对象，进行内生真菌对茅苍术 化过程中形成了一种稳定的互利共生关系 。内 药材优良品质与道地性形成机理的有益探索和实 生真菌具有植物生长调节活性、抗虫活性等多种 践，对于茅苍术野生资源的保护以及可持续利用 生物学功能，使药材具备了优良的抗逆性和生长 具有重要的指导意义。 特性；此外，内生真菌还能诱导和促进药材有效成 参考文献： 分的合成或积累＿８ Ｊ。因此，进行药用植物内生 ［１］国家药典委员会．中华人民共和国药典・一部［Ｍ］．北 真菌生物多样性与种群生态分布的研究具有重要 京：化学工业出版社，２００５：ｌ１１． ［２］Ｎａｋａｉ Ｙ，ｌ＜ｊｆＪ（Ｊ Ｔ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｈｉ． 的理论意义和应用价值。 ｚｏｍｅｓ ｏｆ Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ Ｌａｎｃｅａ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｌａｙ ｏｆ 近年来，由于人为过度采挖以及对生态环境 ｇａｓｔｒｉｃ ｅｍｐｔｙｉｎｇｌＪ］．Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００３，８４（１）：５１—５５． 的破坏，以及由于茅苍术野外繁殖能力低等自身 ［３］钱士辉，汪六英，段金廒，等．茅苍术化学成分及其生物 原因，使得野生茅苍术的资源日渐稀缺，已处于濒 活性研究进展［Ｊ］．中国野生植物资源，２００６，２５（２）：８—１１． ［４］沈萍．微生物学实验［Ｍ］．北京：高等教育出版社， 危状态。因此，为了促进其道地药材的可持续利 ２００４：２１５． 用，需要从多个角度进行茅苍术道地性的探索和 ［５］魏景超．真菌鉴定手册［Ｍ］．上海：上海科学技术出版 实践。本次研究表明，茅苍术内生真菌种群丰富， 社，１９７９：１０１—６４５． 生态分布广泛。内生真菌在茅苍术不同组织中的 ［６￣Ｒａｋｏｔｏｎｉｒｉａｎａ ＥＦ，Ｍｕｎａｎｔ Ｆ，Ｄｅｃｏｃｋ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎ ｆｒｏｍ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ：ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ 种群分布差异明显，具有一定的组织专一性，其原 ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｌ Ｊ］．Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｅｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，２００８， 因除了植物体外环境因素的影响外，还可能是由 ９３：２７—３６． 于宿主不同部位（或组织）微环境如酶、化学物质 ［７ ＪＳｔｒｏｂｅ１ ＧＡ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｉｆｔｓ ｆｒｏｍ ｆｏｒｅｓｔｓｌ Ｊｊ．Ｃａｎａｄｉｎａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００２，２４：１４—２０． 等因素的影响。此外，在茅苍术不同生长期，由于 ［８］Ｓａｉｋｏｎｅｎ Ｋ，Ｗａｌｉ Ｐ，Ｈｅｌａｎｄｅｒ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏ ｅｎｄｏ— 温度、湿度、光照等气候条件的差异，影响内生真 ｐｈｙｔｅ—ｐｌａｎｔ ｓｙｍｂｉｏｓｅｓ ｌ Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，９ 菌对茅苍术的感染、定殖和生长；在不同生长期， （６）：２７５—２８０． 茅苍术体内生理状态不同，代谢存在差异，在气温 ［９］Ｔｏｏｆｎａｅｃ ＢＳ，Ｄｕｌｙｍａｍｏｄｅ Ｒ．Ｆｕｎｇａｌ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ 较高，日照较长的月份，光合作用较强，能合成较 ｉｗｔｈ Ｃｏｒｄｅｍｏｙａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａｌＪ］．Ｆｕｎｇａｌ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００２，１１：１６９ —１７５． 多的营养物质，并且从幼苗期到果熟期，气温逐步 （编辑：李伟东） 升高，这些变化都有利于内生真菌的生长繁殖。