位点可控的二乙氧磷酰化壳寡糖的合成

马力;李克让;李利民;刘蒲

【摘 要】以壳寡糖(COS)为原料,二乙基亚磷酸酯(DEPH)为磷酰化试剂,通过改变反应体系中三乙胺(TEA)的用量控制二乙基磷酰基的进攻位点,实现了 2-N和3,6-O位点二乙基亚磷酰化壳寡糖衍生物的合成,制备了N-二乙氧磷酰化壳寡糖及N,O,O-二乙氧磷酰化壳寡糖,并采用单一变量法对合成条件进行了优化,用31 P NMR对产物进行了跟踪分析.合成N-二乙氧磷酰化壳寡糖的最优反应条件为2 g COS,nCOS∶nTEA=1∶6,nCOS∶nDEPH=1∶3,滴加DEPH和CCl4的时间为2h,低温反应2h,在该优化条件下产物的磷含量为1.50％(质量分数).合成N,O,O-二乙氧磷酰化壳寡糖的最优反应条件为2 g

COS,nCOS∶nTEA=1∶6,nCOS∶nDEPH=1∶5,滴加DEPH和CCl4的时间2h,低温反应4h,常温反应8h,在该优化条件下产物的磷含量为3.42％.对合成反应的可能机理进行了推测.%Using low molecular weight chitooligosaccharide and dialkyl phosphite as raw materials, the site-controlled diethoxy phosphoryl chitooligosaccharides were synthesized through varying the amount of trieth-lamine. Then, N-diethoxy phosphoryl chitooligosaccharide and N, 0,0-diethoxy phosphoryl chitooligosaccharide were obtained. The optimal synthetic conditions were studied by the single factor variable method. And the optimum reaction conditions of N-diethoxy phosphoryl chitooligosaccharide were as follows; 2 g COS, ncos : nTEA = 1 : 6, ncos: nDEPH = 1 : 3, 2 h for the time of dropwise for the solution of DEPH in CC14, 2 h for the time at the low temperature. The maximum phosphorus content achieves 1. 50% under the optimum conditions. The optimum

reaction conditions of N,0,0-diethoxy phosphoryl chitooligosaccharide were as follows: 2 g COS, ncos : nTEA = 1:6 ,ncos : nDEPH = 1 : 5, 2 h for the time of dropwise for the solution of DEPH in CC14, 4 h for the time at the low temperature, 8 h for the reaction time at the room temperature. The maximum phosphorus content achieves 3. 42% under the optimum conditions. Moreover, a possible reaction mechanism was proposed to explain the formation of diethoxy phosphoryl chitooligosaccharides. 【期刊名称】《高等学校化学学报》 【年(卷),期】2012(033)007 【总页数】4页(P1631-1634)

【关键词】壳寡糖;位点可控;二乙氧磷酰化壳寡糖 【作 者】马力;李克让;李利民;刘蒲

【作者单位】郑州大学化学系,郑州450001;郑州大学化学系,郑州450001;郑州大学化学系,郑州450001;郑州大学化学系,郑州450001 【正文语种】中 文

【中图分类】O636.1;TQ316.6+5

壳聚糖是由甲壳素(2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡聚糖以β-1，4糖苷键链接而成的聚多糖)经部分或全部脱乙酰化后形成的产物，是迄今发现的自然界中唯一的碱性多糖［1］.壳聚糖具有多样的生物活性、极好的生物相容性、生物可降解性及无毒性，广泛应用于制药、日用化工、生物医学、生物技术、农业、食品和工业等领域［2，3］.由于壳聚糖本身水溶性较差(除脱乙酰度为50%的壳聚糖)，极大地限制了其应

用，因此，对壳聚糖进行化学修饰是改善其基本性能，扩大其应用领域的重要手段之一.在壳聚糖中引入磷元素形成磷酰化或膦酰化壳聚糖是其改性研究的方向之一［4］.制备含磷壳聚糖衍生物的方法大致可分为壳聚糖与无机磷或有机磷试剂进行反应两类［5］.大部分含磷壳聚糖衍生物是通过壳聚糖的羟基和(或)氨基与无机磷试剂反应制得的［6～8］，只有少数是通过与有机膦试剂反应制得的［9，10］.壳聚糖单元中含有活性的氨基和羟基，由于氨基的活性高于羟基的活性，壳聚糖首先在氨基上发生化学反应，然后才在6-OH及3-OH上发生反应.

本文采用与壳聚糖具有相同结构单元但分子量较小的壳寡糖为原料，通过改变体系中三乙胺的用量、原料的摩尔比及反应时间，实现了不同位点的二乙氧磷酰化壳寡糖衍生物的制备.

壳寡糖(COS)，医用级，Mw=5000，脱乙酰度(D.D.)≥95%，浙江金壳生物有限公司;其它试剂均为分析纯.低温恒温反应浴(DFY-5L/25)，巩义市予华仪器有限公司;德国Bruker公司DPX-400型超导核磁共振波谱仪，将样品溶解在0.1 mol/L DCl/D2O中，样品浓度为30 g/L，1H NMR以TMS为内标，31P NMR以85%(质量分数)H3PO4为外标;美国Thermo公司Fisher IRIS型等离子耦合原子发散光谱(ICP)仪.

根据文献［11］方法制备二乙基亚磷酸酯.1H NMR(DCCl3)，δ:1.27～1.37(t，3H，CH3CH2—)，4.03～4.13(m，2H，CH3CH2—)，5.58，7.86(s，1H，P—H);31P NMR，δ:7.9.

在N2气保护下，将2 g壳寡糖溶于40 mL蒸馏水中，在不断搅拌下，分别加入20 mL无水乙醇和一定量的三乙胺.当体系温度降至－5℃时，通过恒压滴液漏斗滴加一定摩尔比的二乙基亚磷酸酯和CCl4的混合液.反应一定时间，升温至室温继续反应一定时间.反应结束后，将反应混合物倾入350 mL丙酮中沉淀，静置数小时后过滤.将滤饼分别用乙醇、乙醚和氯仿进行浸泡，过滤，然后用无水乙醇提取24

h，真空干燥，得到二乙氧磷酰化壳寡糖.

Ma等［11］曾通过Atherton-Todd反应成功制备了N-二乙氧磷酰化壳寡糖，并进行了结构及性能研究.在此基础上，本文采用三因素三水平正交试验方法研究反应条件对产物磷含量的影响.结果表明，反应的最优条件为 nCOS∶nTEA=1∶6，nCOS∶nDEPH=1∶6，室温下反应时间为8 h.在该最优条件下进行了2次重复实验，得到N-二乙氧磷酰化壳寡糖的磷含量均为2.45%.而正交试验中最高磷含量为3.68%，相差1.2%.

壳寡糖与 DEPH的摩尔比对产物磷含量和31P NMR的影响见图1.从图1可以看出，产物中磷含量随着nCOS∶nDEPH的增加而逐渐增大.当

nCOS∶nDEPH=1∶5时，磷含量达到最大，随着 nCOS∶nDEPH继续增大，磷含量逐渐减小;31P NMR谱图的峰型在nCOS∶nDEPH=1∶3.5～1∶4时由单峰突变为3个峰，而且磷含量也迅速增加.因此，可以将产物分为单峰产物和三峰产物分别进行讨论.合成单峰产物即N-二乙氧磷酰化壳寡糖的最佳条件为

nCOS∶nDEPH=1∶3;合成三峰产物即N，O，O-二乙氧磷酰化壳寡糖的最佳条件为nCOS∶nDEPH=1∶5.

在常温反应时，反应时间不会对单峰产物即N-二乙氧磷酰化壳寡糖的磷含量及磷谱的峰型产生影响.N-二乙氧磷酰化壳寡糖的磷含量随着低温(－5℃)反应时间的延长而逐渐增大.当低温反应时间达到2 h时，产物的磷含量变化不大.因此，选择低温反应时间以2 h为最佳.在滴加DEPH和CCl4混合液的时间为2 h，壳寡糖与三乙胺的摩尔比为1∶6时N-二乙氧磷酰化壳寡糖的磷含量达到最大.

因此，合成N-二乙氧磷酰化壳寡糖的最优反应条件为:nCOS∶nDEPH=1∶3，nCOS∶nTEA=1∶6，DEPH+ CCl4的滴加时间为2 h，低温反应时间为2 h.通过该优化条件得出产物的磷含量为1.50%，该结果要大于未进行实验条件优化时所得产物的磷含量(1.07%)［6］.在最优化条件下进行3次平行实验，得到的产物收

率为72.5%.

实验结果表明，N-二乙氧磷酰化壳寡糖不溶于水，也不溶于一些常见的有机溶剂(如吡啶、DMF、DMAc、DMSO等)，而只能溶解在稀盐酸中，这可能由于二乙氧磷酰基是疏水性基团所致.

N，O，O-二乙氧磷酰化壳寡糖的磷含量随着常温反应时间的延长而逐渐增大，当常温反应时间达到8 h时产物的磷含量变化不大.

当壳寡糖与二乙基亚磷酸酯的摩尔比一定时，随着体系中壳寡糖与三乙胺的摩尔比逐渐增大，产物的磷谱呈现出不同的变化(图2).在nCOS∶nTEA为1∶0～1∶2时，体系是一种弱酸性的环境，这时不能进行Atherton-Todd反应，因此氯代二乙基亚磷酸酯将进攻壳寡糖上的2个羟基，故在磷谱中出现2个峰的产物，即为O，O-二乙氧磷酰化壳寡糖.当nCOS∶nTEA≥1∶4时，磷谱中在δ 9.8处出现新峰，表明氯代二乙基亚磷酸酯和壳寡糖上的氨基发生反应生成N，O，O-二乙氧磷酰化壳寡糖.当体系中三乙胺的量足够大时，即nCOS∶nTEA为1∶16时，此体系的弱碱性足以维持Atherton-Todd反应顺利进行，因此只能生成单峰产物，即N-二乙氧磷酰化壳寡糖.产物的磷含量也达到了1.70%.鉴于nCOS∶nTEA为1∶6时的磷谱图较为理想，因此选择壳寡糖与三乙胺的摩尔比为1∶6. 合成N，O，O-二乙氧磷酰化壳寡糖的最优反应条件为:2 g壳寡糖，

nCOS∶nDEPH=1∶5，nCOS∶nTEA= 1∶6，DEPH+CCl4的滴加时间为2 h，低温反应4 h，常温下反应8 h，得到产物的质量为1.5951 g.通过该优化条件得出产物的磷含量为3.42%.

在水中N，O，O-二乙氧磷酰化壳寡糖表现出了良好的溶解性，达到了“见水即溶”的程度.

二乙氧磷酰化壳寡糖合成的可能机理见Scheme 1.当体系中壳寡糖与三乙胺的摩尔比一定时，随着二乙基亚磷酸酯和CCl4混合物不断滴加到反应体系中，三乙胺

将逐渐被氯代二乙基亚磷酸酯与壳寡糖的氨基反应所生成的HCl消耗，体系的碱性逐渐变弱，将不能顺利进行Atherton-Todd反应，只能形成单峰产物，即N-二乙氧磷酰化壳寡糖.

随着氯代二乙基亚磷酸酯继续滴加到反应体系中，弱酸的环境将更加有利于氯代二乙基亚磷酸酯进攻2个羟基，最终形成N，O，O-二乙氧磷酰化壳寡糖.

当在体系中完全不加入三乙胺或加入的三乙胺量不足时，反应体系呈弱酸性，此时将只能生成O，O-二乙氧磷酰化壳寡糖.

综上所述，通过调节体系中壳寡糖和二乙基亚磷酸酯的摩尔比以及壳寡糖和三乙胺的摩尔比，可以控制二乙氧磷酰基的进攻位点，实现位点可控的二乙氧磷酰化壳寡糖的合成，分别得到N-二乙氧磷酰化壳寡糖及N，O，O-二乙氧磷酰化壳寡糖，三乙胺在合成过程中起到了至关重要的作用，它将决定产物的种类.

KeywordsChitooligosaccharide;Locus control;Diethoxy phosphoryl chitooligosaccharide 【相关文献】

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［11］ Ma L.，Li G.H.，Li L.M.，Liu P..Int.J.Biol.Macromol.［J］，2010，47(4):578—581 AbstractUsing low molecular weight chitooligosaccharide and dialkyl phosphite as raw materials，the sitecontrolled diethoxy phosphoryl chitooligosaccharides were synthesized through varying the amount of triethlamine.Then，N-diethoxy phosphoryl

chitooligosaccharide and N，O，O-diethoxy phosphoryl chitooligosaccharide were obtained.The optimal synthetic conditions were studied by the single factor variable method.And the optimum reaction conditions of N-diethoxy phosphoryl

chitooligosaccharide were as follows:2 g COS，nCOS∶nTEA=1∶6，nCOS∶nDEPH=1∶3，2 h for the time of dropwise for the solution of DEPH in CCl4，2 h for the time at the low temperature.The maximum phosphorus content achieves 1.50%under the optimum conditions.The optimum reaction conditions of N，O，O-diethoxy phosphoryl

chitooligosaccharide were as follows: 2 g COS，nCOS∶nTEA=1∶6，nCOS∶nDEPH=1∶5，2 h for the time of dropwise for the solution of DEPH in CCl4，4 h for the time at the low temperature，8 h for the reaction time at the room temperature.The maximum

phosphorus content achieves 3.42%under the optimum conditions.Moreover，a possible reaction mechanism was proposed to explain the formation of diethoxy phosphoryl chitooligosaccharides.