纳米肿瘤疫苗的制备工艺的优化及特性鉴定(精)

纳米肿瘤疫苗的制备工艺的优化及特性鉴定

[ 11-01-31 10:23:00 ] 作者：李侠 编辑：studa20

【摘要】 目的: 制备无明显毒性、 高效的恶性肿瘤基因工程纳米疫苗。方法: 纯化融合蛋白MH, 薄膜分散－超声法制备包裹MH的纳米脂质体肿瘤疫苗NL（MH）, 并评价其粒径、 包裹率及稳定性; 观察NL（MH）免疫组小鼠的急性毒性反应, 及重要脏器的病理学改变。结果: 成功制备出粒径为（80±250） nm的纳米脂质体, 其药物包裹率为30%, 于4℃放置6个月后或3 000 r/min 10 min离心后无分层, 证明其稳定性良好; 与PBS对照组相比, 免疫组小鼠未见明显毒性反应。结论: 该恶性肿瘤基因工程纳米疫苗具有良好的理化性质, 未见毒性反应。

【关键词】 肿瘤特异性抗原 脂质体 树突状细胞 肿瘤疫苗

肿瘤疫苗能诱导特异性的抗肿瘤免疫反应, 在肿瘤防治上已经显示出一定的效果, 被认为是最具前景的肿瘤治疗方法。本实验室运用MAGE3/Hsp70的融合蛋白免疫小鼠, 结果显示融合蛋白诱导机体产生高效的MAGE3特异性CTL, 对表达MAGE3的B16细胞有很好的杀伤效果［1］

。为了使该融合蛋白能更好地被机体摄取且更好地靶向肿瘤组织, 更有效地激活机体产生针对MAGE3的特异性CTL, 对表达MAGE3的肿瘤细胞具有更强的杀伤作用, 本部分实验中采用纳米脂质体为载体, 包裹MAGE3/Hsp70的融合蛋白（MH）制备恶性肿瘤基因工程纳米疫苗。

1 材料和方法

1.1 材料

分光光度计（UV3000型）为日本岛津公司产品; 透射电子显微镜（JEM2000

EX型）为日立公司产品; 集热式恒温加热磁力搅拌器（DF101B型）为巩义市予华

Parmer公司产品;

仪器有限责任公司产品; 20 kHz/500 watt超声粉碎仪为美国ColeRPMIl640培养基购自

美国Gibco公司; 蛋黄卵磷脂和胆固醇为德国Merck公司产品; 其他试剂均为进口超纯级或国产分析纯级; pET28α（+）

MAGE3/Hsp70质粒由本实验室研制。

1.2 方法

1.2.1 MAGE3/Hsp70融合蛋白的纯化与鉴定

MAGE3/Hsp70融合蛋白的纯化见文献［1］。采用Western blot法对MAGE3/Hsp70融合蛋白进行鉴定, 即取10 μg MAGE3/Hsp70的融合蛋白, 采用20 μL 20 mol/L PBS重悬细胞, 加入20 μL 2×Loading Buffer, 进行SDS

PAGE。采用

80 V, 60 min转移PVDF膜, 50 g/L脱脂乳TTBS室温下封闭PVDF膜60 min, 用TTBS 1∶500稀释MAGE3抗血清, 从封闭液中取出膜, 放入抗血

清中, 37℃ 60 min。TTBS洗膜3次每次10 min, 采用TTBS缓冲液1∶5 000稀释HRP标记的生物素化二抗, 37℃ 60 min, TTBS洗膜, DAB显色。

1.2.2 纳米脂质体的制备及工艺优化

采用薄膜分散超声法制备纳米疫苗, 选用4因素、 3水平正交设计进行工艺优化见

表1（4个因素分别为大豆卵磷脂和胆固醇摩尔比（A）、 脂和水体积比（B）、 超声时间（C）、 PBS的pH值（D）, 以包封率为考察指标来筛选处方）。脂质体具体制备步骤如下：秤取处方量的大豆卵磷脂和胆固醇于100 mL烧瓶中, 加入氯仿1～2 mL, 置于65～70℃ 水浴中, 于旋转蒸发仪上旋转, 减压除去氯仿, 得到磷脂膜。另取溶有目的蛋白（1 g/L）的PBS（ pH=7.5±0.5）20 mL 于小烧杯中, 同置于65～70℃ 水浴中, 保温待用。取预热的PBS, 加至含有磷脂膜的烧瓶中, 65～70℃水浴中搅拌水化10～20 min, 即成脂质体液。取出该液于烧杯中, 置于磁力搅拌器上, 室温下搅拌30～60 min。冰水浴条件下超声10～20 min, 即得脂质体胶体液。0.1 μm聚碳酸树脂纤维过滤3次, 整粒, 得粒径较均匀的脂质体。用0.22 μm的滤膜过滤除菌后, 于4℃保存。表1 各个因素不同配比的正交设计（略）

1.2.3 NL（MH）的性质鉴定

(1)形态观察: 将制成的NL（MH）500倍稀释于生理盐水中, 取100 μL滴于400目铜网上, 1 min后吸去上清, 10 g/L磷钨酸负染色1 min, 自然晾干后在透射电子显微镜下观察其形态。将采集的图象经计算机图象分析, 求得NL（MH）的平均粒径。(2)包裹率及稳定性测定: 采用Sephedex

G100凝胶层析法, 洗脱液为PBS, 流速为0.5

mL/min。取NL（MH）1.0 mL上柱, 收集游离峰即为游离

的MH。同时制备不同浓度的MH标准蛋白样品, Bradford法测定蛋白的含量, 计算出NL（MH）中游离MH的含量。将制备的NL（MH）置于4℃冰箱保存6个月后或3 000 r/min 10 min离心后, 电镜观察纳米脂质体形态, 明确其稳定性。包封率=（系统中的总药量

液体介质中未包封的药量）/系统中的总药量×100%。(3)纳米疫苗急性毒

性: 实验取二级条件C57BL/6小鼠20只, 雌雄不拘, 随机分为2组, 每组10只。PBS对照组：腹腔注射PBS 1.0 mL/鼠; 纳米疫苗（NL（MH）组）: 腹腔注射包封MH的最大

浓度0.3 g/L的纳米疫苗, 1.0 mL/鼠, 观察实验鼠有无急性中毒表现, 并记录两周内死亡小鼠的只数。实验结束时处死动物、剖检（肉眼观察主要脏器的大小、 硬度、 有无胸腹腔积液等）、 取心脏、 肝脏、 脾脏、 肺脏、 肾脏, 用4 g/L的甲醛固定, 石蜡包埋, HE染色, 行病理组织学观察。

1.2.4 统计学处理

应用SPSS11.5统计软件进行数据分析, P<0.05表示有统计学意义, 计量数据结果均以x±s表示。组间差异性比较采用oneway ANOVA。

2 结果

2.1 MAGE3/Hsp70融合蛋白的纯化与鉴定

含有pET28α（+）MAGE3/Hsp70质粒的BL21(DE3), IPTG诱导后进行SPSPAGE, 表达相对分子质量(Mr)为8 700的蛋白。经NiNTA Resin分离纯化系统分离纯化后得到纯度约为90%的蛋白（图1）; Western blot检测于Mr约8 700出现特异性条带（图2）, 证明是MAGE3/Hsp70的融合蛋白。