棉花体细胞胚发生机理的研究进展

棉花体细胞胚发生机理的研究进展

商海红,刘传亮,张朝军,武芝霞,李付广3

(中国农业科学院棉花研究所农业部棉花遗传改良重点开放实验室,河南安阳455004)

摘　要:棉花是一种较难通过体细胞胚发生完成植株再生的作物,而体细胞胚发生是限制棉花基因工程和细胞工程得以广泛应用的主要因素.研究者从不同角度探讨了棉花体细胞胚发生机理并取得了很大的进展,为棉花的遗传转化提供了重要的技术支持,同时成功建立了一些棉花植株再生体系.本文分别从基因型限制、胚胎学、生理生化变化、分子机理等方面阐述了近年来棉花体细胞发生机制的研究进展,并讨论了本研究领域目前存在的主要问题及相应对策.

关键词:陆地棉;体细胞胚发生;畸形体细胞胚;机理中图分类号:Q813

文献标识码:A

ProgressinMechanismsofCottonSomaticEmbryogenesis

SHANGHai2hong,LIUChuan2liang,ZHANGChao2jun,WUZhi2xia,LIFu2guang3

(ChineseCottonResearchInstitute;ChineseAgriculturalAcademyofSciences;KeyLaboratoryofCottonGeneticImprovement,MinistryofAgriculture,Anyang,He’nan455004;China)

Abstract:Becauseitisrelativelydifficulttoobtainsomaticembryosandregeneratedplantsfromcottonviatissueculture,somaticembryogenesisisamainfactorwhichlimitsitsextensiveapplicationoncottonge2neticengineeringandcellengineering.Greatprogresseshavebeenmadeindifferentaspectsofcottonso2maticembryoresearch,andseveralresearchgroupshaveestablishedseriesofplantregenerationsystemofcotton,whichprovidenecessarytechnicalsupportforcottongenetictransformation.Thisarticlereviewstheprogressesincottonsomaticembryogenesisinrecentyears,mainlyingenotypedependenceofsomaticem2bryogenesis,embryologicalstudies,physiologicalandbiochemicalchangesandmolecularmechanisms.Thisarticlealsodiscussestheexistingproblemsinthestudiesofcottonsomaticembryogenesisandthefutureworksinthisfield.

Keywords:GossypiumhirsutumL.;somaticembryogenesis;abnormalsomaticembryo;mechanisms

　　从Davidonis和Hamilton首次获得陆地棉(GossypiumhirsutumL.)再生植株[1],到Trolinder等发现高频体细胞胚发生品种———Co2ker312[2,3],再到陈志贤等获得Coker棉体细胞再生

是一种较难通过体细胞胚发生完成植株再生的作

物,所以体细胞胚发生和植株再生仍是制约棉花基因工程和细胞工程得以广泛应用的主要因素[11].迄今,国内外许多学者从不同角度探讨了棉花组织培养和体细胞胚发生的机制并取得了一系列成果.本文综述了棉花———特别是陆地棉体细胞胚发生机制的研究进展,为全面了解该领域的研究现状和进一

植株[4],经过三十多年的发展,棉花体细胞胚发生和植株再生研究已取得很大进展,建立了一些棉花组织培养和再生体系[5210].但是与其他作物相比,棉花

3收稿日期:2008211228;修改稿收到日期:2009202213

基金项目:国家基础研究发展计划(973计划)项目(2004CB117305)

作者简介:商海红(1978-)男(汉族),在读博士研究生,主要从事棉花细胞工程研究.E2mail:shh9119@sohu.com3通讯作者:李付广,博士,研究员,博士生导师,主要从事棉花基因工程研究.E2mail:lifug@cricaas.com.cn

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步的研究工作提供信息.

1　基因型对棉花体细胞胚发生和植株

再生的影响

　　基因型限制是影响棉花体细胞胚发生的主要原因,即不同品种的棉花体细胞胚胎发生的能力相差

很大.研究发现基因型对棉花愈伤组织的诱导影响不大,但是对胚性愈伤组织诱导和体细胞胚发生具有决定性的影响[2,3,12,13].Trolinder和Goodin认为[2,3],珂字棉(Coker)系统的品种体细胞胚发生能力较强,如Coker312.随着组织培养技术的发展和棉花植株再生基因型范围的拓宽,一些在生产上应用较多、具有优良纤维品质和较好农艺性状的品种

[5]

(品系)已获得再生植株,例如,‘中棉所24’、‘泗

[15]

棉11号’、‘冀合321’、‘鲁棉6号’、‘Deltapine

[8][9]90’、‘PD97019’、‘GA98033’、‘CCRI521’、[10]‘Zhongzhi8626’等.以前普遍认为不同地域棉花品种体细胞胚发生具有一定的差别,如与黄河流域的品种比较,长江流域的品种植株再生能力相对较弱,只有很少一部分品种可以得到再生苗.但是通过

另外,棉花不同类型外植体的体细胞胚发生能力差别很大.体细胞胚发生以下胚轴最容易,子叶较难,真叶和茎最难[18].目前,陆地棉的组织培养主要以下胚轴为外植体,通过脱分化和再分化得到再生植株[18].

2　棉花体细胞胚发生和形态建成过程

中的胚胎学研究

2.1　棉花体细胞胚起源方式以及细胞程序性死亡

棉花体细胞胚起源、形态建成和胚胎学发育等相关的报道较多[19222],这些研究分别从体细胞胚起源、形态建成、胚胎学、细胞程序性死亡(PCD,pro2grammedcelldeath,程序性细胞死亡)等方面探讨了棉花体细胞胚的发生机制.Sharp把体细胞胚的发生方式概括为直接发生和间接发生两种途径[23].陆地棉体细胞胚以间接发生为主[19,20],虽然也有直接发生的报道,但成功的实例很少[24].棉花体细胞胚发育过程与合子胚类似:从原胚、球形胚、心型胚、鱼雷形胚最后到子叶期胚[19,20].关于陆地棉体细胞胚的起源方式一直存在争议,但多数研究者倾向于支持单细胞起源.其主要论据包括:(1)在棉花愈伤组织中发现了与合子胚起源类似的细胞不等分裂、单细胞从二细胞发育到四细胞原胚、细胞向四周分裂产生球形胚以及形成成熟胚全过程的现象[28];(2)发现了与合子胚类似的丝状体和胚柄等胚状体单细胞起源的重要证据[20,21].棉花体细胞胚有的起源于愈伤组织内部近表层部位[20,21],但也有内外同时起源的报道[19].

吴家和等[22]研究发现,陆地棉体细胞胚形成过程中有两次PCD高峰.第一次是愈伤组织脱离下胚轴,在新鲜培养基上培养生长时,一些内含物少的管状细胞发生PCD;第二次是愈伤组织细胞再分化形成体细胞胚时,部分细胞发生PCD.第一次PCD高峰可能与体细胞胚发生时的细胞不对称分裂和胚柄细胞消亡等有关,第二次PCD高峰可能与分化培养基中生长素和细胞分裂素浓度降低有关.

虽然上述研究从不同角度探讨了棉花体细胞胚发生的机理,也取得了重要的研究结果,但是棉花胚性细胞的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)和细胞器的动态变化等重要细胞学事件仍然未见系统性的研究报道.2.2　棉花体细胞胚发生和形态建成过程中畸形胚与畸形苗的发生和转化

棉花体细胞胚发生和再生过程中常伴随出现大

调节培养基中不同激素和无机盐的配比,谢德意等[15]得到了‘鄂抗棉3号’、‘鄂抗棉5号’、‘鄂棉20’、‘鄂棉23’等在长江流域栽培品种的再生植株.虽然棉花植株再生的基因型有了一定拓宽,也建立优化了一些棉花植株再生的试验体系[5210],中国农业科学院棉花研究所还发展了以‘中棉所24号’为模式品种的规模化转基因技术平台[5],但从整体范围看,受体材料的基因型限制仍然制约着生物技术在棉花育种和基础理论研究中的广泛应用[11].

同时,为了探明和转育棉花体细胞胚胎发生的相关基因,很多科学家对棉花体细胞胚胎发生能力的遗传机制进行了研究,结果表明棉花体细胞胚发生能力是可遗传的性状,但可能存在不同的遗传机制[12,14216].如Gawel等认为,体细胞胚胎发生能力为数量性状,具有加性效应[15,16];张家明等认为再生能力是质量性状,受一对隐性主基因控制,还有少数修饰基因在起作用[12].此外,同一棉花品种不同单株间细胞胚发生能力也存在一定差异,利用再生鉴定和单株选育相结合的方法,吴家和等[17]从‘冀棉321’中得到了一个高分化率系.虽然上述研究为了解棉花体细胞胚发生能力的遗传机制提供一定的信息,但由于基因型对体细胞胚发生影响的复杂性以及定位再生性状重要性,棉花体细胞胚发生能力的遗传机制仍然有待再深入研究.

3期　　　　　　　　　　　　　　　　商海红,等:棉花体细胞胚发生机理的研究进展639

量的畸形胚和畸形苗,这些畸形结构的高比例发生严重影响了再生率的提高,一定程度上制约着组织培养在遗传转化、突变体筛选等方面的应用[21,25227],也影响着棉花转基因工程的应用研究.

棉花体细胞胚发生和再生过程中出现的畸形胚状体主要有:联体胚、子叶畸形胚、多极胚、玻璃化胚、白化胚、重新愈伤化胚等类型;畸形苗主要有:生长点畸形、叶片畸形等形态畸形以及白化、重新愈伤化等生理畸形等[21].前人研究表明,畸形胚状体和畸形苗的高比率发生与培养基成分、培养方式、外植体来源、培养时间等均有密切关系[21];培养过程中畸形胚和畸形苗可以向正常苗转化,如果培养条件不合适,正常的胚状体和再生苗也会向白化、玻璃化和重新愈伤化等畸形结构转化[21,25].而通过调整培养基中激素的种类和配比可以获得较多的正常苗,例如,KT(Kinetin,62呋喃氨基嘌呤,激动素)与IAA(32IndoleaceticAcid,吲哚乙酸)有利于正常苗的发生,此外,缩短培养时间也可大大降低畸形结构的发生[21,27].

3.2　棉花体细胞胚发生和形态建成过程中内源激

素的动态变化

棉花组织培养中,体细胞先脱分化为胚性细胞,胚性细胞再分化形成体细胞胚并最终完成植株再生,均主要是通过调节培养基的激素种类和比例完成的.迄今为止报道的棉花再生系统多是在实践经验基础上建立的,针对性不强,通过研究棉花体细胞胚发生和形态建成过程中内源激素的变化规律,可为调节外源激素提供理论依据,也能从更深层次探讨畸形胚和畸形苗高比率发生的原因.鉴于此,Zeng等通过研究陆地棉体细胞胚发生过程和不同

愈伤组织内源激素的动态变化发现[30]:外植体细胞内IAA、iPAs(isopentenyladenosinegroup,iPAs,内源细胞分裂素)、IAA/iPAs比值的急剧升高是非胚性细胞向胚性细胞转变的重要指标,而愈伤组织IAA、iPAs含量过低可能是棉花长期继代分化能力降低的主要原因[30].这些研究结果表明内源生长素和细胞分裂素含量及其比值的变化可能与棉花体细胞胚发生关系密切.

3　棉花体细胞胚发生和形态建成过程4　棉花体细胞胚发生的分子机理研究

棉花体细胞胚发生是体细胞向胚胎途径转变的

复杂发育再建过程,受细胞内外多种因素的共同影响,细胞代谢与基因表达模式也发生着巨大的变化.因此,研究棉花体细胞胚发生过程中胚性基因的差异表达,分离胚胎发育特异表达基因具有重要意义.与棉花体细胞胚发生外在影响因素和细胞学机制的研究比较,有关分子机制的研究报告相对较少[31234].目前,棉花体细胞胚发生分子机理的研究主要集中在胚性愈伤和非胚性愈伤组织在基因表达差异,以及胚性愈伤组织诱导过程中胚性基因的表达等方面,并分离到了一系列体细胞胚特异的基因[31,33,34].

以‘中棉所24号’为材料,通过抑制性消减杂交(suppressionsubstractivehybridization,SSH)等方法,我们实验室分离到了241个与棉花体细胞胚发生相关的非冗余基因(Unigene).例如,与生长素(IAA)信号传导途径相关的基因Auxin2ResponsiveProtein;与乙烯信号传导和合成相关的基因,如转

中的生理生化变化

3.1　棉花体细胞胚发生和形态建成过程中的主要

生化物质代谢

与苜蓿(MedicgosativaL.)、胡萝卜(DaucuscarotaL.)等模式植物相比,棉花组织培养开展较晚,体细胞胚发生和形态建成过程中生理生化变化的相关研究报道不多,研究手段也相对单一.与非胚性愈伤组织相比,胚性愈伤组织中主要生化物质、酶活性、内源激素水平等均有较大差别.如胚性愈伤组织的蛋白质含量以及Glu、Ala、Leu的含量均高于非胚性愈伤组织[20,29];进一步研究发现,在培养基中个别氨基酸的加入与胚性愈伤组织形成有正相关关系,这在一定程度说明生化研究对培养基的优化有一定指导价值[6].刘春明等利用组织化学染色方法研究了棉花体细胞胚发生过程中淀粉的消长规律:淀粉和多糖类物质积累有两个高峰期———原胚形成期和鱼雷形胚晚期[20].张献龙等发现胚性愈伤组织中IAA氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性均高于非胚性愈伤组织,IAA氧化酶与胚性愈伤组织内IAA代谢活性有关;而苯丙氨酸解氨酶与次生物质

如木质素、酚、色素类的代谢密切相关,该酶在胚性愈伤组织中具有较高活性,可能参与了木质素代谢,保证了细胞壁合成而有利于细胞分化[28].

录因子EIN2、棉花12氨基环丙烷212羧酸(ACC)氧化酶2(12aminocyclopropane212carboxylateoxidase2,ACO2)和棉花12氨基环丙烷212羧酸(ACC)氧化酶3(12aminocyclopropane212carboxylateoxidase3,ACO3)等[33].Zeng等还发现锌指蛋白家族(zincfinger2likefamily)、高迁移率蛋白(high2mobility

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groupprotein)等转录因子在棉花体细胞胚发生中

发挥着重要作用[34].此外,脂质转运蛋白(lipid2transferprotein,LTP)等基因同样也在胚胎发生早

期强烈表达[34].

5　棉花体细胞胚发生研究中存在的问

的发生机理以及如何向正常苗转化将是棉花体细胞

胚发生研究中的一个重要方向[25,27].(3)脱分化和再分化是植物细胞全能性表达的两个重要转折点,棉花组织培养中相关的研究主要集中在调节培养基中的激素种类和比例,而内外源激素互作对棉花体细胞胚发生影响的相关研究较少[30,36],应该得到加强,一旦这方面的研究取得突破,现有棉花再生系统中存在的体细胞胚发育不同步、畸形率高、重复性差等问题将有望得到解决.(4)棉花体细胞胚发生分子机理的研究开展得较晚,虽然取得了一些成果,但是与胡萝卜等模式植物相比,研究的深度和广度还有很大差距,一些重要转录因子和信号分子在棉花体细胞胚发生中作用机制的研究还很不够,这将是今后研究中新的焦点[33,34].

总而言之,棉花体细胞胚发生和形态建成受到细胞内外多种因子的共同调控,并最终从转录、翻译以及蛋白质加工等水平上调节体细胞胚发生.目前,由于实验条件和手段的局限,对棉花体细胞胚发生发育中的许多机理和规律的研究还不充分.要想在更深的层面上认识棉花体细胞胚发生的分子机制,实现人为有效调控棉花体细胞胚发生,还需要在生理生化、分子生物学等不同领域进行深入系统的研究.

题及对策

　　迄今为止,棉花体细胞胚发生和植株再生研究取得了很大的进展,建立了一些棉花品种的再生体系,并成为棉花遗传转化技术的重要支持,直接推动了转基因抗虫棉、抗除草剂等棉花品种的商业化[11,35].体细胞胚发生机理研究领域也已取得重要的研究成果,但仍存在一些问题,主要表现在以下几方面:

(1)棉花植株再生的基因型范围狭窄,品种间再生能力差异很大.珂字棉的胚胎发生能力最强,国内品种以鲁棉、冀棉的体细胞胚发生率较高,其他大部分品种的体细胞胚发生率相对较低[13].但能够再生并不表示容易再生,现有再生系统仍然存在体细胞胚发生率低、发育不同步、畸形率高等问题[9,10,30,31].因此,在培养体系进行优化和完善、缩短培养周期、提高植株再生率等方面还有大量工作要做.(2)畸形胚和畸形苗高比率发生制约着植株再生率的提高是目前亟待解决的问题之一,畸形结构

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IntroductiontoCoverIllustration:AcermiaotaienseTsoong

AcermiaotaienseTsoong(Aceraceae)waspublishedin1954byTsoongPu2chiu,aChinesetaxono2

mist.ThespecificepithetisderivedfromMiaotaizi,locatedinLiubaCounty,ShaanxiProvince,wherethetypespeciemenofA.miaotaiensewascollected.Thisspeciesischaracterizedbythefollowingfeatures:Treesto10～20(25)mtall.Barkbrownishgray,rough.Branchletsglabrous;lenticelsrounded;winterbuds

ellipsoid,scales4.Leavesdeciduous;petiole6～7cm,glabrous;leafbladebroadlyovate,(4～)7～9×6～8cm,papery,abaxiallypubescent,adaxiallyglabrous,primaryveins3～5,secondaryveins5～7pairs,basecordateorsubcordate,32or52lobed;lobesovate,marginundulate,apexacute.Inflorescenceterminal,cor2ymbose2paniculate.Flowersyellow2green.Sepals5,oblong,4.5～6.5mm,marginciliate.Petals5,obovate2lanceolate,3.5～4.5mm.Stamens8.Diskorbicular,margin52repand2lobed.Infructescencecorymbose,gla2brous;pedicel3～6mm;samarapubescentorrarelyglabrous.Nutletsflat,ca.8mmindiam.;winginclu2dingnutlet2～2.5(3)×0.8～0.9cm;wingsspreadinghorizontally.Fl.Mar.2May,fr.Jun.2Sep.

A.miaotaienseisendemictoChinaandonlyknownfromTsinglingMountainandthenorthslopeof

BashanMountain,alt.1000～2000m.Itscattersinsummergreenbroad2leavedforestvegetationorshrubs.ThepopulationofA.miaotaienseissmallanditsindividualsareinafewquantity,whichmakesitsnaturalregenerationdifficult.

ThefruitofA.miaotaienseisspecialinthegenus,withwingsspreadinghorizontally.Intheaspectsofgermplasmconservationandevolutionarybiologyofthegenusitisofscientificinterest.NowthespeciesislistedinChinaPlantRedDataBookandhasbeenrankedasthethirdgradeofnationallyprotectedplant,belongingtovulnerablespecies.

(PhotoandTextbyYangPei2jun,WangYongandZhaoHua,ShaanxiUniversityofTechnology)