免疫组化-双重染色

免疫组化双重染色方法和步骤：

在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);不同种属来源的抗体双重染色。目前，最常用的是最后一种方法。

不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。

试剂配制：

1、3％过氧化氢甲醇：30％H2O210ml＋纯甲醇90ml→充分混匀。

2、0.3％过氧化氢甲醇：30％H2O21ml＋纯甲醇99ml→充分混匀。

3、免疫组化专用PBS（pH7.2—7.6）：NaCl8.5g＋磷酸氢二钠（无水）2.8g＋磷酸二氢钠（无水）0.4g溶于双蒸水并定容至1000毫升。然后测pH值使之在7.2—7.6。如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。

4、0.3％TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚）：TritonX－100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。

贮存液：30％TritonX－100：TritonX－100 28.2ml＋0.1mol／LPBS（pH7.3）或0.05mol／lTBS（pH7.4）72.8ml，37℃水浴中2～3h；

工作液：0.3％TritonX－100：30％TritonX－100 2ml用0.1mol／LPBS（pH7.3）或0.05mol／lTBS（pH7.4）定容至200ml。

5、柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）：Boster AR0024按说明配制。

6、封闭液：BSA＋与第二抗体同源血清＋免疫组化专用PBS，使BSA浓度为3％，与第二抗体同源血清浓度为10％。例：BSA0.6克，第二抗体同源血清2毫升，加免疫组化专用PBS定容至20毫升。

7、SABC：按说明配制。

8、DAB（Diaminobenzidine）显色液：按说明配制。

9、1％盐酸－乙醇分化液：浓盐酸1ml＋70％乙醇99ml。

SABC法：

注意事项：

1、片子着色不均匀的原因如下：

① 脱蜡不充分：可以60℃烤20min，立即放入新鲜的xylene1；

② 水化不全：应经常配制新鲜的梯度乙醇；

③ 抗体没混匀：用移液器充分混匀一抗／二抗等试剂；

④ 抗体孵育时，切片放倾斜；

⑤ 抗体孵育后PBS冲洗不充分；

⑥ 制片厚薄不均匀等问题：染片盒不平，切片倾斜。

2、切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色

① 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗／二抗孵育时间、稀释抗体来控制；

② 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；

③ 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

④ 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

⑤ DAB显色时间过长或浓度过高；

⑥ PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；

⑦ 标本染色过程中出现干片，易增强非特异性着色。

SP法

1～6步骤与SABC法相同，但无需使用生物素阻断剂：

7.切片加入A特异性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS冲洗3次，每次5分钟

8.滴加生物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，继而PBS冲洗3次，每次5分钟;

9.滴加链霉菌抗生物素蛋白—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟

10.碱性磷酸酶显色液(BCIP/NBT)显色(紫蓝色).PBS冲洗3次，每次5分钟;

11.滴加0.05%盐酸，室温10分钟(可避免已显色的抗原褪色);

12.滴加抗小鼠二抗同种属的非免疫血清，37~C孵育10分钟;

13.滴加B特异性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育。PBS冲洗3次，每次5分钟;

14.滴加生物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟。PBS冲洗3次，每次5分钟：

15.滴加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟

16.过氧化物酶显色液(AEC)显色(鲜红色).PBS冲洗3次，每次5分钟

17.苏木精复染细胞核;

18.水溶性封片剂封片。

在使用SP法双重染色之前需要对待测抗原的性质、二抗的种属类型和显色系统进行详细设计。购买免疫组化双染试剂盒时;应选择与设计方案相同的配套试剂。在选择一抗时应避免定位在细胞的同一部位(如胞核、胞浆和胞膜)的两种抗原，如果不可避免，最好选择免疫荧光组织细胞化学双重染色方法，因为两种不同颜色的荧光重叠后呈现另一种颜色的荧光(如红色荧光与绿色荧光重叠呈现黄色荧光)，它比SP法的显色系统更容易区别和辨认阳性结果。

在进行双重染色之前，必须对所选择的一抗分别进行单独染色预实验，预实验条件必须与双染条件相同，在观察预实验结果和抗体定位正确后，再进行双染实验。