维普资讯 http://www.cqvip.com 安徽农业科学.Journal ofAnhui Agi.Sci.2007,35(11):3143—3145 责任编辑金琼琼责任校对胡剑胜 过氧化氢胁迫粟水提取物的羟自由基清除活性与成分分析 李景军,陈正行,张潇艳(江南大学食品科学与安全教育部重点实验室,江苏无锡214036) 摘要比较了粟的不同水提取物的羟自由基清除活性,并用不同浓度的过氧化氢进行粟的胁迫萌发研究。在温度30℃、pH值7.0、萌 发48 h的条件下,分析了过氧化氢对幼芽的外观生理形态、粟种的发芽率及其胁迫粟水提取物的羟自由基清除作用的影响,对浓度 1.5 ml/100 ml的过氧化氢胁迫粟水提取物的主要成分进行了测定。结果表明:过氧化氢浓度在0 1.5 ml/100 ml范围时,粟产生适应性 反应,对萌发有促进作用;在浓度1.5ml/100ml时,发芽率为92-3%,羟自由基清除率可达53.4%,比水萌发清除率(10.1%)提高了4 倍多;浓度大于1.5 ml/100ml时,则抑制粟种子萌发。过氧化氢胁迫粟萌发,有助于提高其营养保健价值。 关键词过氧化氢;胁迫;粟;水提取物;羟自由基清除活性;成分分析 中图分类号Q949 文献标识码A 文章编号o5l7—66ll(2007)ll一03143—03 Scavenging Activity on Hydroxyl Free Radical and Component Analysis of Water Extracts from Hydrogen Peroxide Stress MiUet LI Jing-jun et laJiangsu 2 14036) (Key laboratory of Food Science and Safety,School of Food Science and Technology,Southern Yangtze University,Wuxi, Abstract Different contents of hydrogen peroxide were used for the investigation of millet seeds stress germination which was contolrled at 30℃,pH 7.0,gemirnated ofr 48 h.Effect of hydrogen peroxide on the sprout physiological shape in appearance,gemirnation rate and scaveningg activity on hydroxyl free radical were studied.The results showed that the adaptability response to induction happened in seeds and promoted germination in the range of 0一1.5 mL/lO0 mL hydrogen peroxide content.At the content of 1.5 mL/l0o mL.the rate of germination and the hydrogen radical inhibition were 92.3%and 53.4%.respectively.And the inhibition rate enhanced 4 times more than the contolr group.When the content was above 1.5%.germination rate reduced.Therefore.it was practicable to enhance the nutrition and health funotion of millet by the means of hydrogen erpoxide stress germination. Key words Hydrogen erpoxide;Stress;Millet;Water extracts;Scavenging activity on hydroxyl free ardical;Component analysis 过氧化氢(H2O2)是一种活性氧(reactive oxygen species, ROS),很容易透过细胞膜进入细胞,并且通过过渡金属离 子参与的Fenton反应产生羟自由基(OH・),引起机体的氧 后,转入9 cm铺放l层纱布的培养皿内,再加入l5 ml培养 液,最后将培养皿放进避光的生化培养箱中进行萌发。每 12 h ̄l,JJu培养液1次 。每个样品3次重复,以去离子水做 空白对照萌发。 化损伤,即所谓氧化应激【l】。自由基具有高度的化学活性,是 机体有效的防御系统,若不能维持一定水平则会影响机体 的生命活动【2】。有研究表明,氧化应激和过氧化氢的剂量有 1.2.1.3萌发后水提取物的制备。将萌发48 h的粟用去离 子水清洗2次后,与4℃100 ml去离子水匀浆15 min,摇床 转速3 000 r/min离心,收集上清液;沉淀重复提取2次,合 并上清液,置于4℃冰箱中放置12 h后,在温度4℃、摇床 转速8 000 r/min的条件下离心20 min,上清液冻干后4℃ 贮存备用。 1.2.2芽长和发芽率的测定。随机选取l0粒萌发种子以游 关,低剂量的过氧化氢会使机体产生适应性口】。过氧化氢还 是一种分解后无残留的化学物质,是研究工作首选的化学 试剂。笔者以粟为材料,研究了过氧化氢对粟萌发水提取物 的羟自由基清除作用的影响,并分析了其主要成分。 1材料与方法 1.1材料粟种来自吉林省农业科学院作物研究所,发芽 标卡尺测量芽长后取平均值;种子萌发48 h后,按照GB 5520_85的方法测定发芽率。 1.2.3羟自由基清除能力的测定。采用Fenton反应[51,略有 率85%,蛋白质l2-3%,脂肪4.04%,赖氨酸0.25%,千粒 重3.0 g,直链淀粉含量l8.1 g,l【g脱脂米粉,胶稠度126 mm, 糊化温度1.8级(碱消指数级别);试剂:过氧化氢(30%)、 番红花红、考马斯亮兰等,均为分析纯;设备:FAI604S电子 5 ml,2 mmol/L EDTA 375 IXl,260 g/ml番红花红0.2 ml,最 天平、组织捣碎机、LXJ.II离心沉淀机、生化培养箱、培养皿(9 0.0 420 xIl,混合均匀后于37℃恒温水浴并保 cm)、纱布若干;ALPHAl 4/24型冷冻干燥机(德国CHRIST 后加30%H2公司);电热干燥箱(天津市中环实验电路有限公司);DRZ-4 电阻炉温度控制器(河北省黄骅市综合电器厂);SX-25.10 箱式电阻炉(河北省黄骅市卸甲仪器厂);索氏脂肪抽提器; 722 S分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。 1.2方法 改进。在反应体系中,加入pH值7.4的磷酸缓冲液l ml, 2 mmoi/L硫酸亚铁溶液2 ml,超纯水505 IXl,待测样品溶液 温30 min,再加入0.5 ml EDTANa2终止反应,在波长520 nm 处测吸光值。空白组以等体积去离子水代替样品溶液,对照 组以等体积去离子水代替硫酸亚铁溶液。试验结果以自由 基清除率表示。 y=(A样品/A对照)xl00% 1.2.1胁迫粟水提取物的制备。 式中,y为羟自由基清除率;A样 为样品的吸光度值;A对 为对照组的吸光度值。 1.2.4胁迫水提取物的成分分析方法。可溶性糖含量的测 定采用苯酚硫酸法阎,葡萄糖标准曲线回归方程y ̄=57.863 一 1.2.1.1 清洗消毒。粟用0-3%~0.5%次氯酸钠溶液消毒 30 min,清水洗2次,去离子水洗1次。 1.2.1.2浸泡萌发。取10 g粟在室温下用去离子水浸泡8 h 基金项目 江南大学资助项目。 970-),男,吉林长春人,在读博士,讲师,从事植物 作者简介 李景军(1蛋白质功能研究与应用开发。 3.979 5,R2:0.9967;可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝 G-250染色法【71,牛血清白蛋白标准曲线回归方程 -2.5004 0.024 6,R2:0.997 7;脂肪含量测定按照GB 5512-85的方 法;纤维素含量测定按照GB 6193-86的方法;灰分测定按 收稿日期 2007.01.12 维普资讯 http://www.cqvip.com 安徽农业科学 2007丘 照GB 5505-85的方法;含水量测定按照GB 5497-85的方 l00 法;Vc含量的测定采用紫外快速测定法闻,Vc标准曲线回归 方程vF152.7 x+2.718 1,R 0.998;多酚含量的测定采用酒 石酸铁比色法f8]。 2结果与分析 60 8O 辞 2.1粟的不同水提取物的羟自由基清除能力比较由表1 4o 可见,样品A和B的羟自由基清除活性较高,分别为48.08% 和55.56%,说明其中的成分可能有所不同。为鉴别这些活 性成分,对总糖、还原糖、多酚、蛋白质和vc等关键成分进 行检测。其中样品c和D的多酚含量较高,但样品A和B 的羟自由基清除活性较高。表明多酚对此活性的贡献不大, O O.O 0.3 O.9 1.5 2.1 2.7 3.3 3.9 2O H O ,,ml/100 ml 样品对羟自由基的清除作用随还原糖含量的增加而增加, 对蛋白质、总糖和vc来说也是如此。 表1不同样品的羟自由基清除活性与其主要抗氧化成分分析 注:A是B经超滤后得到的水溶性蛋白溶液;B是过氧化氢胁迫萌 发粟的水提取物;C是粟米粉水提取物;D是水萌发粟水提取物。 B~D都未经超滤处理。 4种样品活性的差异说明,胁迫培养基的某些成分可 能是使活性提高的重要原因。样品A和B都是来自过氧化 氢胁迫萌发粟,活性很高,分别为48.08%和55.56%;样品 D来自水萌发粟,活性较低,为10.05%,样品c则来自粟米粉 水提取物,活性最低,为4.69%。这些结果表明,粟的水提取 物具有羟自由基清除活性,萌发粟活性比粟米粉水提取物 要高,进而说明胁迫萌发的活性比一般萌发的要好。因此,过 氧化氢胁迫粟有利于提高水提取物对羟自由基的清除活性。 对比样品A和B的成分可知,所有检测的成分在样品 B中都存在,而A中只含有蛋白质和总糖。说明除蛋白质和 总糖之外,其他成分对羟自由基的清除作用很小。向A中加 入三氯乙酸再离心后,上清液中未发现该活性,这证明了可 溶性蛋白是该活性的主要贡献者。此水溶性蛋白可能含有 类似保护蛋白(pap)的氧化胁迫蛋白 ,还可能含有一些粟 米蛋白水解物和SOD等。 2.2不同浓度过氧化氢对幼芽形态及发芽率的影响 由 表l可见,当过氧化氢浓度低于2.1%时,各组芽长都比空 白对照长,芽体的外观差异不大,较整齐、颜色淡黄色,透光 性比空白对照差;当过氧化氢浓度高于2.7%时,随着浓度 的增大,芽长变短,在过氧化氢浓度偏高时,粟芽不整齐且 弯曲。不同浓度过氧化氢胁迫萌发粟的发芽率见图1。由图 1可见,在浓度小于1.5%时,随着浓度的增加,发芽率不断 提高;在浓度大于1.5%时,发芽率随浓度的增大而降低;浓 表2 不同浓度H20 对幼芽芽长和生理形态的影响 图1不同浓度过氧化氢对粟种发芽率的影响 度在1.5%时,发芽率最高,达到93.5%。这说明低浓度的过 氧化氢对种子萌发有促进作用,高浓度时则有抑制作用。在 低浓度胁迫下,芽长、发芽率都要超过空白对照值,生长正 常、较整齐,这是对萌发有利的表现;当其浓度大于1.5% 时,芽长、发芽率都低于对照值,不整齐,甚至有弯曲现象, 测量偏差变大,这是抑制生长的表现。胁迫粟的芽透光性比 空白(水萌发)的要差,说明其体内的成分比空白对照要复 杂,可能是过氧化氢胁迫使萌发的生理进程提前的原因191。 粟种子萌发对需氧量增加,低浓度过氧化氢在萌发环境中 满足了萌发的需要而提高了发芽率,高浓度过氧化氢容易 使膜结构受损,导致膜功能的降低甚至丧失,从而抑制萌 发。浓度为1.5%的过氧化氢胁迫下,粟的发芽率最高,芽 长偏差最小,最整齐,此浓度对粟萌发可能是最适宜的。 2.3不同浓度过氧化氢对羟自由基清除能力的影响 由 图2可见,过氧化氢溶液胁迫萌发后,粟的水提取物对羟自 由基的清除能力得到较大提高。当浓度低于1.5%时,其清 除能力随过氧化氢浓度的增大而提高;当浓度大于1.5% 时,其清除能力开始下降。说明浓度低于1.5%的过氧化氢 对粟的胁迫强度是适宜的,而浓度高于1.5%的过氧化氢对 粟的胁迫是不适宜的。无过氧化氢胁迫萌发(水萌发)时,其 对羟自由基的清除率只有10.1%,使用浓度1.5%的过氧化 氢胁迫萌发时,其对羟自由基的清除率可达53.4%,后者是 前者的5倍多。可见,要提高萌发粟的羟自由基清除活性, 使用过氧化氢作为诱导试剂是切实可行的,且粟萌发可选 择使用的过氧化氢浓度范围是0~1.5% n】。 就过氧化氢对发芽率和羟自由基清除率的影响来说, 两者变化趋势是基本相似的。 2.4过氧化氢胁迫粟水提取物的主要成分分析对胁迫 60 辞 蜒 书 面 O 1.O 2.O 3,0 4,0 H O ,ml/100 ml 图2不同浓度过氧化氢对羟自由基清除率的影响 维普资讯 http://www.cqvip.com 35卷11期 李景军等过氧化氢胁迫粟水提取物的羟自由基清除活性与成分分析 3145 萌发粟水提取物的主要成分进行分析。结果表明:过氧化氢 性,仅为25%,有的品种更低ll51。高等植物对外界如物理、化 学及微生物刺激具有防御机制,在氧胁迫下会产生氧胁迫 (1.5 ml/lO0 m1)胁迫粟水提取物的主要营养成分中,可溶性 糖总量60.76%,蛋白质18.74%,脂肪0.14%,纤维素1.783%, 水分9.31%,灰分8.12%;3种抗氧化成分中,还原糖含量为 蛋白il6-18]。使用过氧化氢胁迫萌发粟,可以有目的的使其水 提取物对羟自由基抑制作用得到提高,是可行的。 参考文献 f11卫秦芝,庄志雄,袁建辉,等 f氐剂量过氧化氢诱导机体适应性反应 差异表达基因的研究【J1.中国职业医学,2005,32(4):2-6. f21钟耀广助能性食品[M].北京:化学工业出版社,2004:67. 『31薛丽君,金中初.中国仓鼠肺成纤维细胞过氧化适应及其机理【Jl_中 华预防医学杂志,1998,32(5):285—288. SRIPRIYA G,USHA ANTONY,CHANDRA T s.Changes in carbo- hydrate,free amino acids,organic acidsphytate and HC1,extractability of minerlsa duing germination and fermentation of finger millet 16.04%,占总糖的26.4%,vc和多酚含量都很低,分别为 0.02%和0.06%。使用截留分子量为3.5 kD的膜对胁迫粟 水提取物进行超滤,截留液对羟自由基抑制率为46.2%,而 加入TCA后的截留液不显示羟自由基的清除作用。说明还 原糖、vc和多酚对清除羟自由基所起的作用不大,而蛋白 质起很大作用。可见,过氧化氢胁迫粟萌发水提取物具有营 养和保健功能。 3小结与讨论 (Eleusine coracana)[J].Food Chemistry,1997,58(4):345—350. 通过对粟的不同水提取物的羟自由基清除作用的比较 可知,过氧化氢胁迫萌发粟是提高羟自由基清除活性的有 效方法。在温度30℃、DH值7.4、萌发48 h的条件下,使用 过氧化氢胁迫萌发粟发现,低浓度过氧化氢促进萌发生长, 高浓度则抑制萌发生长。在过氧化氢浓度为1.5 ml/100 ml 时,发芽率达92.3%,其水提取物对羟自由基清除率达53.4%, 水提取物有很高的营养价值;而无胁迫的对照组羟自由基 清除率仅为10.1%,有胁迫较无胁迫提高了4倍多。可见, 使用过氧化氢胁迫萌发粟,可以使其水提取物对羟自由基 清除能力得到大幅度提高,具有更好的保健作用。 种子萌发后在酶的作用下,发生一系列生理生化变化, [5]陈美珍,余杰,郭慧敏 大豆分离蛋白水解物清除羟自由基作用的研 究【J】.食品科学,2002,23(1):43—46. [6】陈家华.现代食品分析新技术fM】.北京:化学工业出版社,2004: 228-229. f71吴平.食品分析fM1.北京:轻工业出版社,1985:137—139. f81何照范,张迪清.保健食品化学及其检测技术[M].北京:中国轻工业 出版社,1999:101—102. 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