一、原理
在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自由基（O2－）。利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中O2含量。O2与羟胺反应生成NO2，NO2在对氨基苯磺酸和α-萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对-苯磺酸-偶氮-α-萘胺）。取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根据A530值可以算出样品中O2含量。反应式如下：
－＋－
NH2OH + 2 O2＋H→ NO2＋H2O2＋H2O
－
－
－
－
－
二、试剂：
65 mmol·L磷酸钾缓冲液（pH7.8）
10 mmol·L盐酸羟胺
58mmol·L-1磺胺酸即对氨基苯磺酸（以12mol/L乙酸为溶剂，冰醋酸：水 = 3：1配制）7 mmol·L-1α－萘胺（以12mol/L乙酸为溶剂，冰醋酸：水 = 3：1配制） 50umol·L-1NaNO2母液
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三、实验内容及方法
（一）、亚硝酸根标准曲线的制作
1、NaNO2溶液的配制
取50nmol·mlNaNO2母液，分别稀释成0、10、20、30、40和50umol·L的标准稀释液。
2、测定方法
取7支试管，编0～6号，分别加0、10、15、20、30、40、50umol·L-1NaNO2标准稀释液1ml，然后各管再加50mmol·L-1磷酸缓冲液1ml，58 mmol·L-1对氨基苯磺酸1ml和7mmol·L-1α－萘胺1ml，置于25℃显色20min后，以0号管作空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。 3、标准曲线绘制
以1～6号管亚硝酸根（NO2—）浓度为横坐标，吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线
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（二）、实验组数据测定
1、实验材料：取分别老化0、2、4、6、8、10、12、18、24、48、72h
第一步：称取2g种胚，加入6ml 65 mmol·l-1 磷酸钾缓冲液（pH 7.8）及少许石英砂，冰浴研磨成匀浆，5000×g（4℃）离心10 min。
第二步：
实验组 对照组 空白调零组 磷酸缓冲液 0.5 0.5 0.5 盐酸羟胺 0.1 0 0.1 蒸馏水 0 0.1 0 摇匀，25℃水浴加热10min
实验组 对照组 空白调零组 提取液 0.5 0.5 0 磷酸缓冲液 0 0 0.5 摇匀，25℃水浴加热20min
实验组 对照组 空白调零组
黄胺 1 1 1 摇匀再加α-萘胺 1 1 1 摇匀，25℃水浴加热20min
实验组 对照组 空白调零组
三氯甲烷 3 3 3
10000r/min 离心 3min（5000r/min 6min） ，取粉色水相（上层）测定A530
A530（NO2¯）=A（实验组）—A（空白调零组）
备注： 提取液：称取2 g种胚，加入6ml 65 mmol·l-1 PBS（pH 7.8），冰浴研磨成匀浆，5000×g（4℃）离心10 min，收集得到的上清液。
四、结果计算
根据所测得的A530值，从标准曲线上查得样品中NO2－浓度，按公式（1）即可计算出样品中NO2－浓度。然后依据羟胺与O2－的上述反应，从NO2－对O2－进行化学计量，按公式（2）计算，即将按公式（1）计算得到的NO2－浓度乘2，得O2－浓度。也可根据被测样品与羟胺反应的时间和样品中蛋白质含量，按公式（3）求得O2－的生产率。
从标准曲线查得NO2－（nmol）×提取液总量（ml）
NO2－含量（nmol·g－1Fw）=——————————————————————…（1） 样品重（g）×测定时提取液用量（ml）
将所得NO2－含量代入下式计算，即求出O2－含量。
O2－含量= NO2－（nmol·g－1Fw）×2 ……………………………………………… （2）
将公式（2）所得的O2－浓度及样品中蛋白质含量，依下式计算出O2－产生速率。
O2－（nmol）
－－1－1
O2产生速率（nmol·mg蛋白·min）= ———————————————…（3） 蛋白质（mg）× 反应时间（min）
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