超氧阴离子产生速率测定

超氧阴离子产生速率测定

羟氨氧化法

(王爱国，罗广华． 植物的超氧物自由基与羟胺的反应 ［J］．植物生理学通讯， 1990，(6)：55-57)

一、原理

植物组织器官的衰老总是伴着细胞内膜结构的破坏， 表现为细胞内的电解质大量渗漏出 来。很多研究结果表明，细胞衰老过程中膜的破坏是由细胞中

(特别是线粒体和叶绿体 )产生

的自由基 (如 O2·ˉ、 OH·、O2等 )使膜脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用而造成的。膜脂过 氧化作用中产生的自由基，它不仅能连续诱发膜脂过氧化作用，而且还可以使蛋白质脱

H+

而产生蛋白质自由基， 使蛋白质分子发生链式聚合， 从而使细胞膜变性， 最终导致细胞损伤、 衰老和死亡。

二、材料、仪器设备与试剂

(一) 材料

植物叶片、花瓣等器官

(二) 仪器设备

低温高速离心机、微量加样器 (1mL、20uL) 、精密电子天平、分光光度计、试管、 研钵、剪刀、镊子、烧杯、试管架

(三) 试剂

(1)

0.05 mol ·L-1 磷酸缓冲液 PH=7.8(0.66304g 的 NaH2PO4.2H2O 和 16.3849g 的 Na2HPO4.12H2O

定溶 1000mL ，校正 PH)

(2)

10m mol L·-1盐酸羟胺(NH2OH·HCl，69.49，溶于水)0.3475g定溶到 500mL ，(冷)

(3)

17m mol L·-1 对氨基苯磺酸 (C 6H 7NO 3S 173.19 1.4721g) 或者(C6H7NO3S·H2O

191.21 1.6253g)定溶到 500mL ，(冷，磁 )

-1

(4)

7m mol L·-1α-萘胺， 0.5012g 定溶到 500mL ，(乙醇溶解，定溶，溶解完全 )

三、试验步骤

(1) 制做亚硝酸根标准曲线

2mL 系列浓度的 NaNO 2(5,4,3,2,1,0.5 μg/L) 加入 4mL 对氨基苯磺酸和 4mLa －萘胺于 25℃保温 20min ，然后测定 OD530以［NO2－］和测得的 OD530 值互为函数作图，制的 亚硝酸根标准曲线

(2)

取 0.2g 植物材料，加入 1.0mL 0.05 mol L-·1 磷酸缓冲液 (PH7.8)于冰浴研磨

(3)

研磨物以 12000r/min 离心 15min ，取上清液 0.5mL 加入 0.5mL 磷酸缓冲液和 1mL 10m mol·L-1 盐

酸羟胺， 25℃静置 1h

(4) 值

加入 1mL17m mol ·L -1对氨基苯磺酸和 1mL7m mo·l L -1α-萘胺， 25℃静置 20min ，测其 530 处 OD

四、计算

根据测得的 OD 值，查标准曲线将花瓣中氧自由基含量的 OD 值转换成 ［NO 2－］，依据羟 胺与 O2－的反应式：

－ － +

NH2OH+2O 2－+H +→ NO2－+H 2O2+H 2O 从［NO2－］对［O2－］进行化学计算，将 ［NO 2－］乘以 2 得到［O 2－］。

五、注意：

加样的顺序不能颠倒， 25℃ 是它的反应温度。