—＝＝１３６ 第 卷第１期 ３１ ２２ ’ 食品研究与开发 Ｒ叩研＾司丌，叉 检测分析 肉蛋类食品沙门氏菌分离与菌膜检测 王硕，赵金龙，刘昕煜。朱超，杜欣军 （食品营养与安全省部共建教育部重点实验室天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津３００４５７） 摘要：从天津市市内６区和塘沽区各农贸市场购买肉蛋类样品共计７８份，利用国标方法从中分离沙门氏茵，根据 种内特异性基因片段设计３对引物利用ＰＣＲ方法对分离菌株进行鉴定，结果共鉴定沙门氏菌４株；利用结晶紫染色 方法对４株沙门氏菌菌膜形成能力进行鉴定，其中２株菌膜形成能力较强。该试验结果能够有效反映天津市内肉蛋 类食品卫生状况，并对沙门氏茵的控制提供有益参考。 关键词：沙门氏菌；分离；ＰＣＲ；鉴定；茵膜 Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｆｒｏｍ Ｆｌｅｓｈ ａｎｄ Ｅｇｇｓ ＷＡＮＧ Ｓｈｕｏ，ＺＨＡＯ Ｊｉｎ－ｌｏｎｇ，ＬＩＵ Ｘｉｎ－ｙｕ，ＺＨＵ Ｃｈａｏ，ＤＵ Ｘｉｎ－ｊｕｎ （Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍｉｎｉｓｔｙ ｒｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５７，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｔａｌ ７８ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｈｉｃｋｅｎ，ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｉｖｅｒ，ｅｇｇｓ ａｎｄ ｐｏｒｋ ｗｅｒｅ ｐｕｒｃｈａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｒｅａｓ ｏｆ Ｔｉａｎｊｉｎ ｃｉｔｙ．Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｃｈｉｎａ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｔｈｒｅｅ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈｒｏｕｇｈ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ．Ｆｒｏｍ ｔｈｅ ７８ ｓａｍｐｌｅｓ ４ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ．Ｃｒｆｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｕｌｄ ｆｏｒｍ ｓｔｒｏｎｇ ｂｉｏｆｉｌｍ．Ｔｈｅｓｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｃｏｕｌｄ ｗｅｌｌ ｒｅｆｌｅｃｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ ａｎｄ ｐｏｒｋ ｉｎ Ｔｉａｎｊｉｎ ｃｉｔｙ ａｎｄ ｇｉｖｅ ｓｏｍｅ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｏｎｔｒｏ１． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ＰＣＲ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｂｉｏｆｉｌｍ 沙门氏菌是肠杆菌科中的一种重要的食源性致 病菌，目前世界范围内已经发现２ ７００种以上血清型…， 我国的血清型数量超过２００种 １。沙门氏菌对于人畜 这些接触面上致病微生物通常以生物膜（ｂｉｏｆｉｌｍ）的形 式存在。生物被膜是指微生物依靠分泌胞外的多糖基 质、纤维蛋白、脂质蛋白等多聚物，将自身包裹其中而 都会造成较大危害，在世界范围内的细菌性食物中毒 事件中，沙门氏菌都是一种主要的病源菌，在我国由 形成的大量微生物群落同。细菌形成菌膜的能力代表 着其在环境中的存在能力，即菌膜形成能力越强其污 染食品的机会越多。因此，对于沙门氏菌菌膜形成能 沙门氏菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的７０％～ ８０％ 。目前，沙门氏菌的检测已经成为中国计量认证 进行食品质量安全监控时必检的卫生指标 。在引起 沙门氏菌中毒的食品中，肉、蛋、奶等畜产品约占９０％ １， 因此对这类食品中沙门氏菌的分离、鉴定，对于有效 力及机制的研究，对于其危害性的预测和有效控制， 具有重要的指导价值。 从天津市内６区和塘沽区的农贸市场收集肉蛋 类食品，从中分离沙门氏菌，利用ＰＣＲ方法对其进行 监测该细菌的食品污染情况和有效控制食品中毒事 件具有重要实际意义。 食品中存在的沙门氏菌一般是在加工过程中由 鉴定，并利用结晶紫染色方法对其菌膜形成能力进行 鉴定。这些研究能够反映天津食肉蛋类食品的卫生状 况，并对沙门氏菌菌膜研究奠定良好的基础。 １材料与方法 １．１试验材料 １．１．１试验原料 食品接触表面污染所致，接触面包括工器具、刀具、桌 面、案板、传送带、制冰机、贮冰池、手套、围裙等同，在 基金项目：国家自然科学基金（２０９０５０５８） 作者简介：王硕（１９６９一），男（汉），教授，博士，主要从事食品营养与安 全研究。 从天津市市内６区和塘沽区分别购买鸡腿肉、鸡 检测分析 食茹讲究与器发 第３２０１０年１卷第１２月２期 蛋、鸡肝脏、猪肉各２６、２６、１４、１２份，共计样品７８份， 见表ｌ。 表ｌ 肉蛋类样品购买数量及地点 Ｔａｂｌｅ １ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｕｒｃｈａｓｅｄ ｓａｍｐｌ锰一一 ｅｓ ， 拍 购置地点 购买类别 鸡腿肉 鸡盯脏 猪肉 各 购买总数 河东区 和甲 ： 南开ｉ ３ ２ ２ ２ Ｏ ２ 河西区 红桥 河北区 塘＂“ｉ ｔ区 ６ 他９ ３ 总计 １．１．２主爱试剂 ｌ 肪；、氯化镁孔雀绿复合培养基（ＭＭ）、亚硒酸 盐胱氮酸复合培养基（ＳＣ）、亚硫酸铋培养基（ＢＳ）、改 良月桂基胰蛋白胨肉汤培养基（ｍＬＳＴ）为北京陆桥技 术有限责任公司产品； Ｆａｑ ＤＮＡ聚合酶、分子量标记 ＤＩ ２０００为天根生化科技有限公司产品，其它试剂为国 产分卡斤纯试制。 １．１．３仪器设备 单人单面净化１ 作台ＳＷ—ＣＪ—ＩＦＤ：苏州净化设备 有限公司；制冰机（ＳＡＮ＇￣ ０）；梯度ＰＣＲ仪Ｔｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒ（１（Ｂｉ（３ｍｅｔｒａ）；电泳仪ＤＹＹ一６Ｃ：北京六一仪器 ，一；冷冻离 ｔＬ，￣ＪＬ ５８０４Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ）；回转式恒温调速摇 瓶 Ｊ：海欣蕊自动化设备有限公司；电热恒温培养 箱：犬津市华北实验仪器有限公司‘；电热鼓风干燥箱： 余姚市远东数控仪器厂 １．２方法 １．２．１沙门氏菌分离 参照周标方法ＧＢＴ ４７８９．４—２００３《食品卫生微生 物学检验沙门氏菌》检验进行。 非选择性增菌：无菌条件下取样品２５ ｇ，剪碎后 加入到２２５ ｍＬ蛋白胨水培养基中３６ ｑＣ条件下增菌培 养４ ｈ。 选择性增菌：取非选择性增菌液ｌ０ ｍＬ分别加人 到１００ ｒｎＬ ＭＭ培养摹和ＳＣ培养基中，３６ ｃ【＝条件下增 菌培养ｌ８ ｌ卜２４ ｈ 选择性平肌分离：接种环接种增菌液划线于亚硫 酸铋平邶．中．． １．２．２ ＤＮＡ提取 挑取可疑菌落，培养至对数生长期细菌（ＯＤ＝０．５～ ０．７），取２ ｍＬ菌液室温６ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３ ｍｉｎ收集菌 体；去上清，ＴＥ ｂｕｆｆｅ洗涤后，５００ ｔｘＬ提取液（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｌ ３ ＝＝．． Ｔｒｉｓ—ＨＣ１ ｐＨ＝８．０，２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ ｐＨ＝８．０，１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１，１％ＳＤＳ）重悬，沸水浴２ ａｒｉｎ；冷却至室温，加入 ０．６倍体积酚：氯仿：异戊醇（２５：２４：１）混匀，４℃１２０００ ｒ／ｍｉｎ 离心ｌ５ｍｉｎ；取上清，加入０．６倍体积氯仿：异戊醇（２４：１） 混匀１ ｎｌｌｉ，ｌｌ４ ｏｃ １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ；上清转至新 管，加入１／ｌＯ体积的ＮａＡｃ（３ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ＝５．２）和２倍体 积无水乙醇，一２０℃沉淀３０ ｍｉｎ，４ ｃ【＝１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心 １５ ｒａｉｎ；７５％乙醇洗涤沉淀，４ １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ；去上清，无菌室风干沉淀，加人３０ Ｌ～５０ Ｌ ＴＥ 溶解，一２Ｏ℃保存备用。 １．２．３引物合成 为确认为沙门氏菌，根据ｉｎｖＡ基因和相关报道Ｉｓ－。１， 设计合成３对种内特异性引物，其中２条为ｉｎｖＡ基因 特异性，１条为基因组中特异片段特异性，具体引物序 列见 表２ 表２沙门氏菌鉴定所用引物 Ｔａｂｌｅ ２ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ １．２．４ ＰＣＲ鉴定 以提取ＤＮＡ为模板，分别以３对引物进行ＰＣＲ 扩增，鉴定是否为沙门氏菌，ＰＣＲ条件为：９４℃３ ｍｉｎ； ９４℃３０ Ｓ，４８ ｏＣ４５ ｓ，７２℃２０ Ｓ，３５个循环；７２ｃｃ １０ｒａｉｎ。 １．２．５菌膜形成能力鉴定 根据文献报道方法［１ｏ－ｕ］，稍加改动后检测菌膜形 成能力。将一８０℃冰箱保种菌株接人５ ｍＬ的ｍＬＳＴ培 养基中，３７℃条件下２００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养过夜；取４Ｏ Ｌ 菌液接人４ｍＬ的ｍＬＳＴ培养基中，３７℃条件下２００ｒ／ｍｉｎ 振荡培养至ＯＤ６００＝０．５；在９６孔细胞培养板中分别加 人３０ ｕＬ菌液和１００ ｔｘＬ ｍＬＳＴ培养基，３７ ｃＣＩ培养２４ ｈ， 在６００ ｎｍ条件下测菌液生长情况；无菌水洗板，室温 干燥；加入１３０ ｔｘＬ １％的结晶紫染色３０ｍｉｎ；无菌水 洗板（３次），加入脱色剂（乙醇：丙酮＝７：３）脱色１０ ａｒｉｎ； 检测ＯＤ６００吸光值。每个菌株共检测３次。 ２结果 ２．１分离菌株ＤＮＡ提取 利用简易方法提取的ＤＮＡ完整性较好，条带无 脱尾现象，结果见图１，利用细菌１６Ｓ ｒＲＮＡ对提取 ＤＮＡ进行扩增，扩增结果良好。 —＝＝＝１３８ 第卷第１期 ３１ ２ Ｍ ｂｐ ２３ １ ３０ 刚食品讲究与开发 妖ａ霸趼九司丌凰 检测分析 在细胞培养板培养后，菌液生长情况良好，且差 异不明显。结晶紫染色后，其中２号菌株菌膜形成能力 最好，３号菌株次之，结果见图３。为消除菌液生长差异 所造成的影响，利用结晶紫染色后与染色前的比值作 图，结果显示２号菌株菌膜形成能力明显高于其它菌 株，结果见图４。 ４ ３６１ ９ ４ｌ６ ６ ５５７ 表３各地区样品沙门氏菌污染情况 Ｔａｂｌｅ ３ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ａｒｅａｓ ２ ３２２ ２ Ｏ２７ １为分离菌株ＤＮＡ；Ｍ为ｈＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢ。 图１分离菌株ＤＮＡ提取 Ｆｉｇ．１ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ２．２沙门氏菌鉴定 根据沙门氏菌种内特异分子靶标设计３引物，利 用分离菌株ＤＮＡ作为模板，利用ＰＣＲ方法从７８份样 品中共检出沙门氏菌４株，结果见图２，均来源于猪肉 表４不同食品沙门氏菌污染情况 Ｔａｂｌｅ ４ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ 样品，总检出率为５．１％，猪肉类样品检出率３３．３％， 肌肉和鸡蛋均没有检出，结果见表３、表４： ２Ｉ３菌膜形成能力鉴定 ｈｐ ２ ０００ ｌ ０００ ７５０ ５００ ２５０ ｌＯＯ １－４为引物ｓａｌｍ ＦＩ和ｓａｌｍ Ｒｌ对４株分离沙门氏菌扩增结果；５－８为引物ｓａｌｍ Ｆ２和ｓａｌｍ Ｒ２对４株分离沙门氏菌扩增结果；９—１２为引物 ｓａｌｍ Ｆ３和ｓａｌｍ Ｒ３对４株分离沙门氏菌扩增结果。 图２分离菌株ＰＣＲ鉴定 Ｆｉｇ．２ ＰＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ 的分子生物学方法，能够将鉴定周期缩短至２ ｄ，并且具 ３讨论 有操作简便、灵敏度高等优点，在某些领域已经取代传 统方法加以应用。根据相关文献报道的沙门氏菌种内 特异基因序列设计３对引物同时进行检测，均为阳性 的确认为沙门氏菌，这样确保了试验结果的可 传统的沙门氏菌鉴定方法要经过非选择性增菌、 选择性增菌、选择性平皿分离、生理生化鉴定、血清型 鉴定５个步骤，需要４ ｄ～７ ｄ才能够完成检测ｆ１２ｌ。而ＰＣＲ 方法作为一种新型的以种内特异性基因作为检测靶标 靠性。 检测分析 食品研究与开发 第３２０１０年１卷第１２月 ２期 １ ｌ Ｏ ０ ０ Ｏ Ｏ ４ ２ Ｏ ８ ６ ４ ２ ０ １ ２ ３ ４ 不同沙门氏菌分离株 图３菌膜形成能力鉴定 Ｆｉｇ．３ Ｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ 丑 ｊ盂 蛆］ 不ｌ司沙门氏菌分离株 图４菌膜形成能力鉴定 Ｆｉｇ．４ Ｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ 细菌生物膜是细菌在抵抗不利的生存环境，通过 合成水合多聚物黏附与固体表面形成的一种结构。目 前，细菌生物膜的形成对人类主要存在两方面的危害： 一是通过生物膜结构，使细菌能够对抗抗生素或机体 免疫系统的作用，从而造成机体的持续性感染，引起慢 性呼吸道感染、肺炎反复发作、慢性骨髓炎、亚急性感 染性心内膜炎等ｌｌ３ ；另一方面，细菌以生物膜的形态附 着于食品原料、食品加工器械、食品加工场所的表面， 使其能够抵御消毒剂的作用而存活，从而污染食品，造 成食品安全事件。因此对于生物膜的研究具有重要的 实际意义。 生物膜是一种异质性的结构，即不同微生物形成 的生物膜在结构成分与形成机制上均有差别。生物膜 的结构比较复杂，主要由胞外多糖、蛋白构成，有研究 表明ＤＮＡ也是生物膜的一种重要成分㈣。目前，对于 生物膜形成机制的研究主要集中于少数几种细菌，包 括大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌、金黄色葡萄球菌、单 增李斯特菌等，研究手段主要是通过转座子突变单个 基因来展开。目前已经筛选到许多生物膜形成相关基 １３９＝＝＝一 因，例如大肠杆菌中的鞭毛蛋白合成基因、葡萄球菌的 ｉｃａ操纵子和盯 操纵子、假单胞菌中的ｅｌｐ基因、ｐｈｏ 调节子、鞭毛蛋白合成基因等。对于沙门氏菌的研究 表明菌毛和纤维素是决定其菌膜形成的关键因素，而 对于其形成的机制还知之甚少。本研究将在筛选得到 的菌膜形成能力较强菌株的基础上，研究其在不同条 件下形成菌膜的基因基础，这将能够有效推进对于沙 门氏菌菌膜形成机制的认识，为沙门氏菌的控制提供 理论基础。 参考文献： ［１】王云华，龙丽坤，蔡先全，等．文时荧光ＰＣＲ方法检测水产品中 沙门菌ｌＪＪ．中国国境卫生检疫杂志，２００８，３ｌ（２）：１２５—１２７ ｆ２１付丽红，王晓闻．酶联免疫吸附法在沙门氏菌检测中的研究进 展［Ｊ］＿中国酿造，２００９，２０２（１）：１—３ 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