分子生物学技术在土壤微生物多样性研究中的应用

分子生物学技术在土壤微生物多样性研究中的应用

张海龙,石 竹

(山东教育学院生物科学与技术系, 山东 济南 250013)

摘要:土壤微生物传统的分离培养和鉴定方法所具有的困难性和局限性,是难以深入了解微生物生态学特性和多样性组

成方面的主要障碍。分子生物学方法可研究和表征那些目前还不能够被培养的土壤微生物,获取关于土壤微生物群落多样性的更多更完整的信息。本文介绍了当前研究土壤微生物多样性的各种分子生物学技术,并分析比较了各种实验技术的特点和应用前景。

关键词:土壤微生物;土壤微生物多样性;分子生物学技术

中图分类号:Q938.1 文献标识码:A 文章编号:1008)2816(2006)06)0145)05

1 土壤微生物多样性研究的意义1.1 土壤微生物多样性的定义

微生物生态学是研究微生物群体与其周围的生物和非生物环境条件相互作用关系的科学,了解微生物群体的多样性是其中的一个重要任务。土壤微生物与动物的种群变化,土壤有机质的积累,及主要元素地球化学循环的改变是恢复生态的重要环节。土壤微生物多样性则是指生命体在遗传、种类和生态系统层次上的变化,它代表着微生物群落的稳定性,也反映土壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响。土壤微生物多样性还可以定义为微生物生命的丰富性,通常以土壤生物区系的变化和生物化学过程间的相互关系来反映。

1.2 土壤微生物多样性研究的重要性

人类社会的日益扩张,导致人类加速占据地球表面景观,并胁迫地球上生态系统提供不断增长的资源需求和废物吸收能力。而土壤是所有陆地生态系统的结构与功能基础。土壤微生物是土壤的重要组成部分,它参与土壤有机质分解、腐殖质形成等生化过程,是土壤有机质和土壤养分转化与循环的主要动力。此外,土壤微生物还是土壤养分的储备库和植物生长可利用养分的一个重要来源,是土壤肥力水平的活性指标,在土壤生态系统中起着非常重要的作用。植物通过影响土壤环境,从而影响到土壤微生物的结构和多样性,植被多样性和土壤微生物群落多样性之间有着密切的相互关系。同时,土壤微生物的多样性及变异性,可以反映他们对环境的适应性。许多对植物或动物有害的物质如酸害、杀虫剂、重金属等超过一定限度同样会影响或危及土壤微生物。鉴于此,有人提出借助土壤微生物

对各种污染物的效应来进行土壤污染诊断和确定土壤环境容量标准[1]。因此,深入研究土壤的微生物多样性十分必要。

2 应用于土壤微生物多样性研究的各种分子生物学技术

以往,对于土壤微生物多样性的研究是建立在传统的微生物培养和分离技术上。由于这种方法人为限定了一些培养条件,无法全面反映微生物生长的自然条件;而且,可培养微生物在自然界中仅占很小的一部分(土壤中约为0.3%)。为了摆脱对培养技术的依赖,20世纪80年代末至90年代初发展起来的一系列分子生物学研究方法和理念被广泛应用于微生物生态学的研究中。以下简要介绍了近年来应用于土壤微生物多样性分析的各种分子生物学技术,并就各种实验方法的主要应用及各自的优势和局限性进行分析阐述。

2.1 土壤总DNA复性分析

研究表明,土壤微生物大体的群落组成和总的遗传多样性可通过测定群落DNA的解链行为和复性率来确定

[2]

。

微生物多样性越复杂,DNA的同源性越差,复性率就越低。

Sandaa等[3]用这种方法研究了受不同程度重金属污染的土壤中微生物多样性的变化。DNA复性动力学分析表明未受污染的对照土壤含有16000个细菌基因组,受低浓度重金属污染的土壤含有6400个细菌基因组,而受高浓度重金属污染的土壤含有2000个细菌基因组,分别比对照下降了60%和90%。分析表明,重金属污染浓度越高,土壤微生物多样性越低。但该方法的分辨率低,单独使用此技术只能确定土壤微生物群落的大体差异,不能准确说明微生物群落多样性的变化,要得到更精确的结果,还需要结合核酸杂

收稿日期:2006)09)11

作者简介:张海龙(1979)),男,山东寿光人,讲师。 # 146 # 张海龙等:分子生物学技术在土壤微生物多样性研究中的应用 2006年第6期

交等专一性更强的技术。2.2 标记核酸探针杂交技术

核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种新的分子生物学技术。它是基于核酸分子碱基互补配对的原理,用特异性探针与待测样品的DNA或RNA形成杂交分子的过程。由于它的高度特异性和灵敏性,近年来被广泛应用于土壤微生物多样性的研究。用于微生物多样性研究常用的探针主要有rRNA基因探针、抗性基因探针和编码代谢酶基因探针等。特别是近年来发展起来的荧光原位杂交技术是研究环境中不可培养微生物群落多样性最为常用和有效的手段。

荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列,以荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针,与环境基因组中DNA分子杂交,检测该特异微生物种群的存在与丰度。该方法的特点是可以进行样品的原位杂交,可以鉴定细胞形态和微生物种群组成,也可用于鉴定细胞活性和计数。Yang

[4]

不仅影响微生物数量,而且也使种群DNA水平发生了变化。这从某一方面证明了微生物DNA分子与环境因子之间存在着复杂的信号网络,使其适应环境,导致了物种群落结构的多样性。尽管这项技术无须进行特定生物体的描述,但要弄清楚环境中微生物的数量和联系,特别是与已知序列的基因相似性,需要一个大的数据库,不适合大量样本的分析。

2.3.2 限制性片段长度多态性(RFLP)技术

限制性片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpoly-morphism,RFLP)技术是利用限制性内切酶特性及电泳技术,对特定的DNA片段的限制性内切酶产物进行分析,根据片段的大小不同以及标记片段种类和数量的不同,评价微生物的群落结构及多样性。赵勇等[8]应用PCR-RFLP及PCR-TGGE技术监测了一块农田在一个月内土壤微生物的动态变化。结果表明,细菌16SrDNA和真菌18SrDNA的PCR-RFLP图谱在5个采样时间点上基本一致;细菌的PCR-TGGE图谱平均有40条带,其相似性在90%以上,真菌的平均有20条带,其相似性在70%以上。说明这块农田土壤细菌区系短期内变化不大,而真菌区系存在较小幅度的动态变化,并且细菌多样性远远高于真菌多样性。目前该方法已越来越广泛用于土壤微生物多样性的研究。2.3.3 扩增性rDNA限制性酶切片段分析(ARDRA)技术

扩增性rDNA限制性酶切片段分析(AmplifiedribosomalDNArestrictionanalysis,ARDRA)技术是基于PCR技术选择性扩增rDNA片段,再对rDNA片段进行限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)。Tiedje[9]等用该法检测了除草剂二氯苯氧乙酸对土壤中微生物群落结构的影响。V.Torsvik[10]应用ARDRA和DGGE结合的手段成功的比较出了两种农田的微生物多样性和群落结构的不同变化。

由于此方法不受菌株是否纯培养的限制,不受宿主的干扰,具有特异性强,效率高的特点,因此被广泛应用于新物种的发现、微生物分类及鉴定、共生菌、病原菌的微生物遗传多样性的检测等。但ARDRA方法最大的缺点是工作量大,目前,应用该方法进行微生物群落结构分析,还没有人设置重复。

2.3.4 末端限制性酶切长度片段多态性(T-RFLP)技术

末端限制性酶切长度片段多态性(terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism,T-RFLP)是在用细菌通用引物PCR扩增16SrRNA基因时,在其中一条引物的5.末端用荧光素进行标记,然后对土壤样品DNA进行PCR扩增。扩增产物16SrDNA经特定限制性内切酶消化后,电泳分离,荧光素标记的末端片段显色后,可以比较精确的确定标记末端的片段长度,或对其进行测序,根据特异片段的数量可以表明微生物区系的多样性,还可根据已知序列鉴定到种,荧光强度的大小可以确定种的丰富度[11]。

T-RFLP克服了ARDRA方法工作量大、分析烦琐的缺等用FISH方法检测了四氯乙烯(PCE)污染地

[5]

区降解菌Dehalococcoides的丰度。Ritz等应用整个群落

DNA杂交技术,研究了在不同条件下土壤微生物群落结构的变化。结果亦表明,污染的程度越高,土壤微生物多样性越低;但也有实验表明FISH方法对于土壤样品的灵敏度较低

[6]

。

PCR是1985年由Mullis发明的一种聚合酶链式反应技

2.3 建立在PCR技术的分子生物学方法

术,主要特点是短时间内在实验室条件下人为地控制并特异扩增目的基因或DNA片段,以便于对已知DNA片断进行分析。PCR技术的发明和不断完善,不仅为分子生物学的发展做出了巨大的贡献,同时也为分子微生物生态学的发展和分析技术的建立提供了有利工具。目前,在微生物生物多样性领域应用最为广泛的是以微生物的16SrRNA保守性基因为基础设计引物进行PCR扩增,分析基因序列研究微生物群落的多样性。

2.3.1 16SrRNA基因序列分析(16SrRNA-PCR-Sequenc-ing)

16SrRNA为原核生物核糖体中一种核糖体RNA,大小约1.5kb左右。其种类少,含量大(约占细菌RNA含量的80%),分子大小适中,存在于所有的生物中,在结构与功能上具有高度的保守性。16SrRNA基因序列分析主要基于已建立的微生物16SrRNA基因序列数据库,由于16SrDNA及23SrDNA的序列,每年都以很快的速度补充到GenBank中去,这使得能够比较方便地利用这一数据库进行微生物群体多样性的研究。Roane[7]等通过16SrDNA序列分析检测,结果表明金属污染的土壤中可培养的微生物数量减少了,但可分离出抗性微生物,其中分离到的假单胞菌菌株H1随着金属Cd浓度的增高,其抗性也增强,可见污染环境总第118期 山东教育学院学报 # 147 # 点,同时又保留了ARDRA方法分析精度高、能获得土壤微生物系统发育信息的优点,是研究土壤微生物多样性和结构的一种有效而快速的手段。目前,RDP数据库

[12]

SSCP)技术的基本原理是单链DNA片段中碱基的改变,会使其构象发生改变,而空间构象有差异的单链DNA分子会在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈现不同的带型,从而可以非常敏锐地区分大小相同但二级结构不同的PCR产物。

SSCP方法已经成功用来研究根系微生物和高温堆肥的微生物群体组成以及污染条件下的微生物生态多样性。Frank等[15]人通过对根系微生物的分析表明,SSCP可以很好地分析微生物群落的动态变化,并应用此方法研究了种植对土壤微生物群落的影响。SabinePeter等[16]人用该法研究群落的演替和菌种的多样性,并同传统的培养方法比较,指出SSCP方法避免了传统培养的费时费力以及误差大的于扰,适合对微生物群落结构和演替的分析。2.3.8 DNA扩增片段电泳检测(DGGE,TGGE)技术

变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)技术和温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientge-lelectrophoresis,TGGE)技术开始时在医学上用于检测基因突变,后来被广泛应用于微生物生态的研究。同样大小的DNA序列由于含有的碱基不同,各片段的Tm值也就不同,甚至一个碱基对的不同,都会引起Tm很大的差异,DGGE或TGGE就是应用这种差异来区分不同的基因序列。在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺(DGGE),从正极到负极梯度递加,或是形成温度梯度(TGGE)。电泳中的DNA到达它的变性甲酰胺浓度或温度时,双链部分解开,造成泳动速度发生变化,从而达到分离效果。而且染色后的凝胶用成像系统分析,还可以半定量地测定样品DNA浓度的大小,反映微生物群落组成的变化。PCR扩增土壤样品的16SrRNA的部分基因序列(100~400bp),通过DGGE或TGGE分离收集不同条带的DNA测序,再同GENEBANK中现有的序列比较即可确定微生物种类。该方法分析土壤微生物群落结构组成具有快速、重复性好等优点,目前在土壤微生物群落结构分析上应用最为广泛。但该方法在对土壤微生物群落结构进行精细解析上具有一定的限制性,因为对于G+C含量相同但碱基序列不同的片段难以区分。

贾建丽等[17]应用PCR-DGGE技术,通过对中国不同区域环境下的油田区石油污染土壤微生物多态性的评价,探讨微生态环境与微生物多态性之间的内在关系,初步揭示环境胁迫下微生物多态性与降解活性之间的制约性。结果表明,提取的石油污染土壤微生物总DNA产率为3.45~11.7Lg/g(以土壤质量计算),纯度为1.5~1.87,土壤含油率通过制约微生物的数量和活性而对总DNA产率产生影响。在含水率较高的华东地区,其样品微生物种群多样性最高,DGGE条带数为西北地区样品的2~5倍。经过2个月的强化生物降解,东北地区样品的DGGE条带数约为原始样品的75%。

2.3.9 重复基因外回文序列-PCR

REP-PCR(Repetitiveestragenicpalindromic-PCR)通过(http://rdp.cme.msu.edu/htm1)已经建立了T-RFLP数据库,研究者只需把自己的T-RFLP片段类型与数据库已知类型比较,不必测序即可知道菌株的系统类群。2.3.5 随机扩增片段多态性DNA(RAPD)技术

随机扩增片段多态性DNA(Randomlyamplifiedpolymor-phicDNA,RAPD)的基本原理是利用一系列不同的碱基随机排列的寡聚核苷酸单链作为引物对所研究的基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离,EB显色或放射性自显影来检测扩增DNA片段的多态性,这些扩增的DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。姚健影响。

RAPD技术是一种优于RFLP技术的DNA分子标记方法。它继承了PCR技术效率高、样品用量少、灵敏度高、检测容易等优点,同时又有其独特之处。首先,RAPD反应引物是随机排列的,无须专门设计,引物较短,使得RAPD技术可以在对物种没有任何分子生物学研究下,对其进行DNA多态性分析,构建这些物种的基因指纹图谱,并通过统计分析和分类研究提供分子生物水平的依据。再次RAPD技术可以直接对所检测的DNA多态性进行分析,省去了许多(制备、克隆、同位素标记、分子杂交等)工作。但是RAPD技术较容易受到各种因素的影响。无论是模板质量和浓度,短的引物序列,PCR循环次数,基因组DNA的复杂性,技术设备等都是RAPD技术重复性差的直接原因。2.3.6 扩增片段长度多态性(AFLP)技术

扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymor-phism,AFLP)是基于PCR和RFLP的一种DNA指纹技术。其原理是利用限制性内切酶水解基因组DNA产生不同大小的DNA片段再进行选择性扩增,使用双链人工接头与基因组DNA的酶切片段相连接作为扩增反应的模板DNA,用含有选择性碱基的引物对模板DNA基因选择性扩增,获得的DNA扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测,根据扩增片段长度的不同检出多态性。

AFLP技术与其他的DNA指纹技术相比具有效率高、重复性好,分辨率高的特点。但同时也存在着一些缺点,如:AFLP技术费用昂贵;AFLP分析需要同位素或非同位素标记引物,必须具有放射性同位素操作过程中特殊的防护措施以及配套的仪器设备;AFLP对DNA纯度和内切酶的质量要求较高,基因组DNA酶切不完全极有可能影响实验。

2.3.7 单链构象多态性(SSCP)技术

单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism,[13]

和王勐骋等

[14]

应用RAPD研

究了农用化学品污染对土壤中微生物群落DNA多样性的

# 148 # 张海龙等:分子生物学技术在土壤微生物多样性研究中的应用 2006年第6期

使用特定的引物(REP,BOX,ERIC)与染色体上的DNA重复序列随机结合,得到的电泳图谱能够显示种内各个菌株之间DNA指纹图谱的微小差异,因此适合做特定种内不同菌株的差异分析[18]。Roane等[19]用ERIC-PCR的方法分析了从Cd污染土壤中分离出的若干菌株的遗传特征,通过16SrRNA测序,分别鉴定为节杆菌(Arthrobacter)、芽孢杆菌(Bacillus)和假单胞菌(P.seudomonas)。Dhmva

[20]

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REP-PCR的方法对总石油烃(TPH)污染土壤中降解菌香茅醇假单胞菌(P.citronellolis)进行了种内的细致分类,29株香茅醇假单胞菌被分为l2个不同的基因组型。3 结语

本文介绍了当前研究土壤微生物多样性的各种分子生物学的实验技术。从传统的微生物培养法到现代分子生物学的各种实验技术,以过去的微生物群落结构分析为基础,今后将对以功能基因为基础的群落结构进行分析,特别要通过研究功能基因在自然环境中的表达调节,以弄清微生物在环境中的真实的状态。随着各种新技术的不断完善与发展,特别是分子生物学技术的发展,我们能够不断深入地研究土壤微生物多样性,更好的探索土壤中的未知微生物。我们将会逐渐了解到自然生态环境中微生物群体多样性及实际的生存状态,进而可以通过施肥等各种农业措施调整土壤微生物的种类及数量,人为引入一些有益微生物,抑制有害病原菌的发展,提高土壤生态肥力,增强土壤生态系统对资源的供给和对废物的吸收净化能力,促进整个陆生生态系统的良性循环,改善人类的生存环境,实现人与自然的和谐与可持续发展。但新的实验方法均有各自的特点和优势,又有其局限性,因此,多数学者认为任何一种实验技术所得的数据都是其它方法的补充。为了深入研究土壤微生态特征,应采用多种实验方法。随着各种实验技术和方法学的进一步完善,我们看到了越来越多的土壤生态微观世界的奥秘,同时,也对土壤微生物多样性的研究提供了更广阔的研究空间。参考文献:

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ApplicationofMolecularBiologicalTechnologytoResearch

ofSoilMicrobiologyDiversity

ZhangHailong,ShiZhu

(DepartmentofBiologicalSciencesandBiotechnology,ShandongInstituteofEducation,Ji.nan250013,China)

Abstract:Studyonsoilmicrobiologydiversityinthepasthasgreaterlimitationforonlythosemicrobesthatcanbecultured.Molecularbio-logicaltechnologycanbeusedtostudyandcharacterizesoilmicrobeswhichcurrentlycannotbeculturedandtogetmoreandcompletein-formationaboutsoilmicrobialcommunity.Thistextintroducedthewholebagoftricksmolecularbiotechnologyincurrent,comparedeachspecialtiesandtheapplicationprospect.

Keywords:Soilmicrobiology;Soilmicrobiologydiversity;Molecularbiotechnology

(上接第135页)参考文献:

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StudiesonStructuralCharacteristicsofZnOThinFilmsGrownon

Si(111)SubstrateatVariousGrowthTemperature

YuYuanxun1,WeiXianqi2,ManBaoyuan2

(1.ShandongInstituteofEducation,Ji.nan250013,China;2.ShandongNormalUniversity,Ji.nan250014,China)

Abstract:TheZnOthinfilmshavebeenfabricatedonSi(111)substratebypulsedlaserdepositionatgrowthtemperaturefrom100eto500eataoxygenambientpressureof1.3Pa.ThestructuralcharacteristicsofZnOthinfilmswerecharacterizedbyX-Raydiffraction(XRD)spectra,theatomicforcemicroscopy(AFM)observations,andthetransmissionelectronmicroscopy(TEM)observations.There-sultsoftheXRDspectraandtheTEMobservationsshowthatthecrystallinefilmwithbetterstructurecanbeobtainedatgrowthtemperatureof400e.TheresultoftheAFMobservationsshowsthatthethinfilmgrownat400ehasthemostsmoothsurfaceandthehomogeneouscrystalgrains.

Keywords:PLD,ZnOthinfilm,crystalstructure,surfacemorphology