根系分泌物提取

1、 根系分泌物的提取分离

采用两种不同的试剂进行浸提，通过 GC-MSS行物质鉴定，得出适宜马尾松根 系分泌物的提取方法。

方法一：分别取马尾松、枫香根际土壤于有盖玻璃瓶中， 按 1：3的比例加入 85% 的乙醇，至于20C磁力搅拌器，2600rpm浸提24h。再置于20C高速离心仪中， 3500rpm旋转15min。离心后上清液，置于旋转蒸发仪脱去浸提剂，用乙酸乙酯 (1:1)萃取2次，乙酸乙酯相为中性组分；再用1mol/L的HCI将水相的pH 值调至 3.0 后，再用等量的乙酸乙酯萃取 2 次，乙酸乙酯相为酸性组分；再用 1mol/L 的 NaOH 将水相 pH 值调至 8.0，再用等量的乙酸乙酯萃取 2次，乙酸乙 酯相为碱性组分。合并酸、中、碱性乙酸乙酯相，即为马尾松、枫香根系分泌物 提取液。 方法二:分别取马尾松、枫香根际土壤置于有盖玻璃瓶中，按 1: 3的比例加入 20%乙酸乙酯，置于20r磁力搅拌器中，2600rpm浸提24h。再置于20C高速离 心仪中，3500rpm旋转15min。离心后的上清液，即为马尾松、枫香根系分泌物 提取液。 2、根系分泌的鉴定

将上述两种浸提方式得到的马尾松、 枫香根系分泌物提取液，35 E真空旋转蒸发 仪浓缩至1ml，无水硫酸钠脱水后，供 GC-MS测试分析。 检测仪器为GC-MS Agilent-6890N/59731 (美国安捷仑公司)，

色谱条件：色谱柱(Agile nt 122-3832): 30nK0.25mm<0.25um, DB-35ms； 进样口温度250r；程序升温：柱温70r (2min)，以10C. min-1升温至280E， 20min;载气：He；流速：1.0ml • min-1。

质谱条件：El源(电子轰击源)；轰击电压：70eV;离子源温度：230E ；扫描 范围m/z: 35-500amu;扫描速度0.2s扫全程；检测器电压 500V;电流350uA； 四级杆温度：150E ;溶剂延迟时间3.0min;进样量：1.0uL;不分流进样。GC-MS 数据应用标准质谱谱库NIST02获得，采用面积归一化法计算各类物质的相对含 量。

方法三：烤烟根系分泌物的研究 高欣欣

1、具体方法为：取定量过滤后的收集液用乙酸乙酯萃取，得到 乙酸乙酯

相为中性组分；将剩余水相用

1M HCI调节pH至2后，

再用乙酸乙酯萃取， 得到乙酸乙酯相为酸性组分； 将剩余水相再 用

1M NaOH 调节 pH 为 8，用乙：酯萃取， 得到乙酸乙酯相为 碱性组

分， 将酸性、 碱性和中性乙酸乙酯萃取液分别减压浓缩至 1ml (45°C),过 0.45 卩 m 滤膜。

2、 根系分泌物的硅烷化处理

利用常文理于 1990 年提出的方法， 将乙酸乙酯萃取后的上述浓 缩样品中分别加入 0.25mL硅烷化试剂(BSTFA:TMC=5:)，加盖 密封后于80 C水浴中衍生 2 h,待测。 原因是什么？？？？

3、 GC-MS 分析条件

经硅烷化处理后的各组分根系分泌物采用 Agilent7890A-5975C 进行仪器分析测定。毛细管柱采用

HP-5MS柱(30m x 0.25mm x

0.25 a m),进样口温度为250 C,升温程序为50C( 2min),以 6 C /min

程序升温至250 C(保持15min )。载气为 He,流量 1ml/min，进样量为

1 a I，离子源温度 230 C，轰击电压 70eV。

应用 NIST98 质谱数据库,分析质谱图,确定物质组成。 方法四：刺槐根系分泌物的研究 石鑫

第一种 提取办法是参考了尹玉莲等人对橡胶树以及王晗光等人对巨桉根系分泌 物测定时的超声浸提法。此办法操作较为简单 , 只需要将过筛后的土壤放入具塞 锥形瓶

中 ,加入正己垸 到完全淹没土样 ,再超声浸提 20-30min, 过 0.45um 微孔 滤膜,将过滤的溶液在35C条件下旋转浓缩至2mL,即得到根系分泌物的待测液 （尹玉莲等,2008; 王晗光等,2009） 。

第二种 是三性萃取法 , 该方法参考了张汝民等对梭梭的根系分泌物提取的经验。 首先取根系土 lOOg于容量瓶中,加入蒸馏水50ml,置于20C摇床中，IOOrpm消 化24 h。再将容量瓶放于20T高速离心仪中,3500rpm旋转15min。将离心后上 清液用乙酸乙酷萃取2次,得中性成分；再将上清液用Imol/L的HC1调PH至4, 萃取,得酸性组分；用Imol/L的NaOH各上清液的PH值调至9,萃取得碱性组分。 合并乙酸乙酯相，在35° C旋转蒸发仪中浓缩至0.5ml,即得到根系分泌物待测液 （ 张汝民等 ,2007） 。

方法三是邵东华、宁心哲、樊石磊等对油松、 虎榛子根系分泌物实验时萃取硅烷 化法的改进。首先称取lOg 土样放入烧杯，用50 mllmol/L的NaOH溶液淋洗植 株根系，收集洗液，倒入盛有lOg 土的烧杯中；放到20E摇床上,180rmin消化IOh; 过滤2-3次,取20mL滤液，调节pH值到2.5-3，滴入饱和NaCl,用乙醚萃取3次， 合并醚相 , 转入心型瓶中 , 旋转浓缩至干 ； 滴入甲醇 , 溶解瓶壁上物质 , 并移入直径 为1.8-2.0mm毛细管，抽干；加入8ul硅院化试剂,lOO'C衍生Ih后便为待测液（邵 东华等,2011）

使用的第四种方法 是陈华君、金幼菊等人在对杨树等根系分泌物测定时的萃取甲 酯化提取方法。首先取200g跟际土，加入适量70%勺乙醇，超声10min,此步骤重 复3次。抽滤、减压浓缩、离心。将上清液 40ml用2 mol/L的HC1调pH至2-3, 用 O.lmol/L 乙酸饱和的乙酸乙酯萃取 3次, 将有机相合并 ,在 4（rC 条件下解压浓 缩至干,CH2N2甲酯化后，即为酸性物待测液。再取上淸液 40m用0.1 mol/L磷缓 液缓液调pH>8,用O.lmol/L 憐缓饱和的正丁醇萃取 3次，将有机相合并，在 55° C条件下解压浓缩至干，用硅烷化试剂进行 TMS衍生化,即为碱性物待测液 （陈华君等,1 997）

方法三：梭梭幼苗根系分泌物提取方法的研究＊

1.4 根系分泌物的收集和提取

张汝民

根系分泌物的水浸提取 :取生长良好的梭梭幼苗 ,将其无损伤从石英砂中取出 用

500ml蒸馏水浸石英砂24h,浸提液离心，上清液用乙酸乙酯萃取其酸性、碱性 和中性成分。方法为 :将离心上清液用乙酸乙酯萃取 3 次（每次用乙酸乙酯 10ml）, 得到乙酸乙酯相为中性组分；将水相用1M HCl调节pH至3后，再用乙酸乙酯萃取 3次（每次用乙酸乙酯10ml）,得到乙酸乙酯相为酸性组分；将水相再用1M NaOH调 节pH为8,用乙酸乙酯萃取3次（每次用乙酸乙酯10ml）,得到乙酸乙酯相为碱性组 分,将酸性、碱性和中性（原液）乙酸乙酯萃取液减压浓缩至 行

GC/MS 分析。根系分泌物的循环灌溉收集 :将生长良好的梭梭幼苗培养盆下面安 装一个塑料管与根系分泌物收集器相连接 ,通过收集器中 XAD-16 树脂吸附根系 分泌物后的溶液又循环到培养盆中，如此连续循环5d后，将收集器中XAD-16树脂 吸附的根系分泌物用甲醇洗脱，收集洗脱液为梭梭根系分泌物提取液。然后，45C 减压浓缩至1ml,再用1ml乙酸乙酯萃取，用于进行GC-MS分析测试。

1ml（45C ）,用于进

将野外采集沙棘根系及根系表面 0-3mm 土壤然风干，土壤过100 g。称取IOg 土放入烧杯 ；用 50mnrnol/L 的 NaOH 溶液淋洗沙棘根系 ,收集洗液 ,倒入盛有 lOg 土的烧杯中：放到20OC摇床上,180r/min消化IOh;过滤2-3次，取20mL滤液调节 pH值到2.5-3,滴入饱和NaCl,用乙醚萃取3次，合并醚相,转入心型瓶中，旋转浓缩 至干:滴入甲醇，溶解瓶壁上物质，并移入到直径为1.8-2.0mm毛细管中，抽千;加入 8卩硅烷化试剂，100C衍生Ih; GC/MS检测分析。