牛奶中蛋白质含量的测定

牛奶中蛋白质含量的测定

摘要：通过国标牛奶中蛋白质的测定找出它的不足之处，用新的方法进行蛋白质的测定。

关键词：蛋白质 测定凯氏定氮法微 波消解—凯式定氮法 Bradford法 甲醛值滴定法

牛奶是一种营养丰富而全面的理想食品,是人体所需蛋白质的重要来源,蛋白质是牛奶中的主要营养指标。因此，牛奶中蛋白质的测定是一件非常重要的事，也是大家非常关注的事。

用凯氏定氮的方法检测蛋白质含量。

蛋白质测定的国标规定方法——凯氏定氮法介绍【GB/T 5009.5—1985】

食品中蛋白质的测定方法

本标准适用于各类食品中蛋白质的测定。

1 原理

蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

2 试剂

所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。

2.1 硫酸铜。

2.2 硫酸钾。

2.3 硫酸。

2.4 2%硼酸溶液。

2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。

2.6 40%氢氧化钠溶液。

2.7 0.05N硫酸标准溶液或0.05N盐酸标准溶液。

3 仪器

定氮蒸馏装置：如图所示。 （图略）

4 操作方法

4.1 样品处理：精密称取0.2～2.0g固体样品或2～5g半固体样品或吸取10～20ml

液体样品(约相当氮30～40mg)，移入干燥的 100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20ml 水。放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。

4.2 按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

4.3 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。

同时吸取10.0ml试剂空白消化液按4.3操作。

4.4 计算

式中：X——样品中蛋白质的含量，%；V1——样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；

N——硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；0.014——1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；m——样品的质量(体积)，g(ml)；F——氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。

附加说明： 本标准由全国卫生标准技术委员会食品卫生标准分委员会提出，由卫生部食品卫生监督检验所归口。 本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。

微波消解—凯式定氮法 凯式定氮法是测定蛋白质含量的法定方法，测定结果稳定、准确，但此方法存在消解时间长，使用消解溶剂用量大，易造成环境污染等缺点。 而微波消解具有操作简便、消解速度快、所需消解溶剂少、消解能力强等优点。本文采用微波消解法代替凯式定氮法中的消化方式，减少了试剂用量，缩短了消解时间。试验表明，该测定方法与传统的凯式定氮法无显著性差异，适用于大批量蛋白质含量的测定。

仪器 MDS－2003F 微波消解仪；凯式定氮蒸馏装置；KDN－08C 型恒温消解仪；FA2004 型电子天平；可调温电炉。所用玻璃仪器均以 20 ％硝酸浸泡过夜，用水冲洗，去离子水冲洗干净。

主要试剂硫酸，优级纯；过氧化氢（30 ％），分析纯；硫酸铵（标准品）；氢氧化钠溶液（400 g/L）；硼酸溶液（20 g/L）；盐酸标准溶液（0.050 8 mol/L）；甲基红－溴甲酚绿混合指示剂 （1 份 0.1 ％甲基红乙醇溶液与 5 份 0.1 ％溴甲

酚绿乙醇溶液临用时混合）。

样品消化准确称取 0.5 g 样品放入消解罐中， 加入 3 mL 硫酸和 1.5 mL 过氧化氢，盖好密封碗，装好罐，在设定的消解程序下进行消解处理，如样品消解不完全有黑色碳粒， 可再加入 0.5 mL 硫酸和 0. 5 mL 过氧化氢继续消解。 消解完毕，待消解罐充分冷却后，将消解液转移至 25 mL 容量瓶中，用少量去离子水洗涤盖子、安全阀和消解罐的内壁一并转入容量瓶，用去离子水定容待测。 同时做空白试验。

样品测定取 5 mL 消化好的样品溶液进行凯式定氮蒸馏，加入一定量的 40 ％的氢氧化钠溶液使蒸馏器内的内溶物变棕色为止， 馏出液用 0.050 8 mol/L 的标准盐酸滴定，溶液颜色由蓝色变为紫红色为滴定终点，计算蛋白质含量。总蛋白质/%=M(V1-V2)*14*6.38*100/1000/W 式中：M 为标准盐酸的摩尔浓度，mol/L；V1为滴定样品时消耗盐酸溶液的体积，mL；V2为滴定空白消化液时消耗盐酸的体积，mL；W 为样品的重量，g；14为氮的相对原子量。

微波消解是近年来产生的一种崭新的样品处理技术，它结合了高压消解和微波快速加热两方面的性能。 该法的优点是：①微波加热是“内加热”，具有加热速度快、加热均匀、无温度梯度、无滞后效应等特点。②消解样品的能力强，特别是一些难溶样品，传统的消解方式需要数小时甚至数天，而微波消解只需要几分钟至十几分钟。 ③溶剂用量少， 用密封容器微波溶样时，溶剂没有蒸发损失，一般只需溶剂 5 mL~10 mL。 ④减少了劳动强度，改善了操作环境，避免了有害气体排放对环境造成的污染。 ⑤由于样品采用密闭消解，有效地减少了易挥发元素的损失。

优点 将蛋白质测定中消解方法改为微波消解法，由于样品与试剂的反应是在密闭的容器内进行的，所以对环境的污染大大减小，采用硫酸和过氧化氢混合液为消解试剂，试剂用量少，消化速度快且消化彻底。 仪器在设定的程序下，可自动完成消解操作，操作方便，减轻了分析人员的工作强度，提高了工作效率。

三聚氰胺事件引发的食品安全问题已经影响了整个食品行业。它属于难代谢物质，如果进入人和动物体内能不同程度的导致肾衰竭或者死亡，还能导致结石诱发膀胱和泌尿系统疾病，因此对牛奶中的蛋白质测定也提出了更高的要求。经典的食品蛋白质（包括牛奶）含量的测定，方法繁琐，耗时长，最关键的是样品中所有的含氮物质中所含的氮元素，都被转换成硫酸铵，充当了蛋白质含量。因此导致了个别不法商家向牛奶中添加含氮物质如尿素、三聚氰胺等，危害消费者的身体健康。牛奶中蛋白质的测定，一般使用凯氏定氮法，须经强酸消化，然后蒸馏，再经滴定，方法繁琐，耗时长（约需2-3ｈ）；而且凯氏定氮法测定的是样品中所有的含氮物质，无法区分蛋白质氮还是非蛋白质氮，而采用Bradford法测定蛋质含量，步骤简单，耗时短（约需0.5ｈ），并且考马斯亮蓝试剂与尿素和三聚氰胺不发生显色反应，可用于牛奶中蛋白质含量的快速测定。样品、干扰品制备 用水将牛奶稀释得50倍牛奶稀释样品；另取部分稀释液加入尿素使之浓度为0.2ｍｇ／ｍＬ，再取部分稀释液加入三聚氰胺使之浓度为0.5ｍｇ/ｍＬ。

材料、试剂与仪器 牛奶；染色剂：考马斯亮蓝，称取100ｍｇ考马斯亮蓝Ｇ－250染料溶于50ｍL95％的乙醇后，再加120ｍL85％磷酸，用水稀释定容到1L。混合指示剂：10ｍL1ｇ/L的甲基红乙醇溶液与5ｍL1ｇ/L的亚甲基蓝乙醇溶液混合。盐酸标准滴定液 ：0.0530ｍｏｌ/L。标准蛋白质溶液：1.0ｍｇ/ｍL的牛血清白蛋白；尿素、三聚氰胺、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸、氢氧化钠、95％乙醇：皆为国产分析纯；可见分光光度计：722Ｎ，上海精密科学仪器有限公司；凯氏定氮仪：江苏江都市红旗玻璃厂；分析天平：ＡＲ1140。

Bradford法操作步骤

(1)标准曲线的制作：取７支试管，依次加入0，0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10ｍＬ的1.0ｍｇ/ｍＬ标准蛋白质溶液，用水补充到0.1ｍL，最后加入5.0ｍＬ考马斯亮蓝

染色剂，每加完１管立即混匀。反应2-5min后比色，以0管调零，于595nm波长测定各管吸光度，并制作标准曲线。

(2)待测管：取30支试管分为3组，第一组加入0.1ｍL的50倍牛奶稀释样品，第二组加入0.1ｍＬ的尿素干扰样品，第三组加入0.1ｍL的三聚氰胺干扰样品，测定吸光度。根据标准曲线求得相应蛋白质含量。

(3)凯氏定氮法操作步骤 取10支定氮瓶，分别加入5.0ｍL牛奶，加硫酸铜0.2ｇ，硫酸钾6ｇ，硫酸20ｍL，2粒玻璃珠，瓶口置一漏斗，置于电热板上小心加热，待内容物完全碳化，加大火力，消化至透明，继续加热半小时放冷，将消化液定容至50ｍL。同时做空白。向收集瓶内加入10.0ｍL硼酸溶液（20ｇ/L）及2滴混合指示液。取10ｍL消化液由小玻杯加入反应室，用10ｍL水洗涤，再加10.0ｍL氢氧化钠溶液（400ｇ/L），盖紧塞子，加水密封，加紧旋夹，蒸馏10min。蒸馏液用0.0530mol/L盐酸滴定液滴定，计算出样品蛋白质含量。氮换算蛋白质系数以6.38计.

比较 试验中按照牛奶内最大含氮量加入干扰物三聚氰胺或尿素，结果显示，干扰物三聚氰胺或尿素，对吸光度无影响。因此对于Bradford法而言，牛奶中添加三聚氰胺或尿素，无法提高表观蛋白质含量，这是Bradford法与凯氏定氮法最大的区别。本法存在的问题是，所测定的蛋白质含量与凯氏定氮法所测定的含量有一定偏差，经多次测定结果比较，将Bradford法测定结果乘以1.1等于凯氏定氮法结果，目前，尚不了解引起该偏差的原因。

甲醛值滴定法快速测定牛奶中蛋白质含量

我国现行国家标准方法是以食品中的含氮量为依据测定蛋白质含量,测得的结果不完

全是蛋白质,还包括一些非蛋白质类的含氮物质,如尿素氮、游离氨氮、无机氨盐等;国标GB/T 5009·5—2003食品中蛋白质的测定规定的凯氏定氮法、可见分光光度法完成一个样品的测定,需要3 h以上,不能满足快速测定的需要,更难以解决牛奶中蛋白质的掺伪检验难题。本文参考文献资料[2]研究并建立了牛奶中蛋白质的快速检验方法-甲醛值滴定法,测定牛奶蛋白质中游离氨基酸含量,计算求得牛奶中蛋白质含量。本方法准确、简便、快速并有效地解决了非蛋白质类的含氮物质对牛奶与奶制品中蛋白质测定结果的干扰问题。

方法原理牛奶中蛋白质含量与游离氨基酸含量呈良好的正相关。氨基酸为两性电解质,在接近中性的水溶液中,全部解离为双极离子。当甲醛溶液加入后,与中性的游离氨基酸中非解离型氨基反应,生成单羟甲基和二羟甲基诱导体,使氨基酸失去氨基特性,游离的羧基(-COOH)可以用标准碱溶液滴定,根据碱溶液的消耗量得出游离氨基酸含量,乘以经验常数计算出蛋白质的含量。

仪器 碱式滴定装置。样品 3个品牌的成品纯牛奶和1个企业的鲜原料牛奶。试剂 饱和草酸钾溶液:330 g/L;酚酞指示液:5g/L,用乙醇溶液配制;氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=0·1 mol/L];氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH)=0·05 mol/L];中性甲醛水溶液。

测定方法准确吸取奶样10·0 ml于三角瓶中,加入0·5 ml饱和草酸钾溶液和0·5 ml酚酞指示液,约2 min后用0·1 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至粉红色。然后加入2 ml中性甲醛溶液,再用0·05 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至粉红色,记录滴定消耗的0·05 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。

结果表述牛奶中蛋白质的含量X(g/100 ml) =CV1*0·014*6·38×100*100/5.006/V 式中:C—氢氧化钠标准滴定溶液的浓度,单位为mol/L;V1—加入中性甲醛溶液后,滴定试样消耗氢氧化钠标准定溶液的体积,单位为ml;0·014—1ml 1 mol/L氢氧化钠标准溶液相当

于氮的克数;6·38—氮换算为蛋白质的系数;100/5·006—经验常数,由本方法实测值与国标法(凯氏定氮)测定值相比较计算得出;V—样品的体积,ml成品。计算结果保留三位有效数字。

现行国标方法不能排除非蛋白氮对测定结果的影响,而甲醛值法有效地解决了非蛋白氮干扰问题,适用于牛奶与奶粉中重要的营养指标蛋白质的快速定量检验。本方法与现行的国标方法(凯氏定氮法)相比,牛奶中蛋白质的测定时间缩短为3-5 min,提高工作效率约50倍,适用于牛奶中蛋白质的快速定量检验。

此外，还有一些方法来测定牛奶中蛋白质的含量，比如用直接电位法测定牛奶中蛋白质含量等等。

参考文献：

1. 蛋白质测定的国标规定方法——凯氏定氮法【GB/T 5009.5—1985】

2. 沈文，陈均志，代春吉微波消解—凯式定氮法测定牛奶中蛋白质含量食品研究与开发2009（5）30-5

3. 田志梅甲醛值滴定法快速测定牛奶中蛋白质含量中国食品卫生杂志2008.20-3

4. 张志涛刘金生等Bradford法测定牛奶中蛋白质含量安全与检测2011.5