青岛农业大学学报（自然科学版） ３２（３）：１５７～１６２，２０１５ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｑｉｎｇｄａｏ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ 文章编号：１６７４—１４８Ｘ（２０１５）０３—０１５７—０６ 肝脏特异性ＩｇＤ．高表达转基因小鼠的构建 张希瑶 。，王喜凤 ，潘庆杰 ，闵令江 （１．青岛农业大学动物科技学院，山东青岛２６６１０９；２．中国农业大学生物学院，北京１０００９３） 摘要：ＨＩＤＳ（高ＩｇＤ综合征）的引发可能与ＩｇＤ的升高有关。本试验利用５’ＲＡＣＥ技术和免疫球蛋白可变区基因 的特异性扩增方法来构建小鼠ｓＩｇＤ（分泌型ＩｇＤ）重链与轻链可变区基因，利用３’ＲＡＣＥ扩增得到ｓｌｇＤ重链与轻 链的恒定区基因，融合ＰＣＲ方法得到ｓｌｇＤ全长。我们分别构建了ｅＡＦＰｐＡＬＢ—ｓＩｇＤＨ、ｅＡＦＰｐＡＩ Ｂ—ＩｇＬ、ｅＡＦＰ— ｐＡＬＢ－－ＧＦＰ和ｅＡｐｏＥｐＡＡＴ－－ｓｌｇＤＨ、ｅＡｐｏＥｐＡＡＴ－－ＩｇＬ、ｅＡｐｏＥｐＡＡＴ－－ＧＦＰ载体，先进行细胞水平上的初步检 测，接着构建了转基因小鼠。对转基因小鼠的检测得知，ｓｌｇＤ在肝脏和脾脏中ＲＮＡ水平上有少量表达，后续对转 基因小鼠各个脏器的ＲＣＲ及Ｑ—ＰＣＲ检测发现，ｓＩｇＤ在肾脏中有的较高表达。 关键词：ＩｇＤ；高ＩｇＤ综合征（ＨＩＤＳ）；转基因小鼠 中图分类号：Ｑ７８６ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７４—１４８Ｘ．２０１５．０３．００１ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ—ｌｅｖｅｌ Ｌｉｖｅｒ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩｇＤ ＺＨＡＮＧ Ｘｉｙａｏ ～。ＷＡＮＧ Ｘｉｆｅｎｇ ，ＰＡＮ Ｑｉｎｇｊｉｅ ，ＭＩＮ Ｌｉｎｇｊｉａｎｇ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１０９，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ Ｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＨＩＤＳ）ｍａｙ ｂｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＩｇＤ．Ｏｕｒ ｓｔｕｄｖ ｕｓｅｄ ｔｈｅ ５’ＲＡＣＥ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ／ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉ— ａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｂｕｉｌｄ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＩｇＤ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｗｅ ｕｓｅｄ ３’ＲＡＣＥ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｔｏ ｂｕｉｌｄ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ．Ｔｈｅｎ ｗｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ＩｇＤ ｔｈｒｏｕｇｈ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ．Ｗｅ ｂｕｉｌｔ ｓｉｘ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖｅｃｔｏｒｓ，ｓｕｃｈ ａｓ ｅＡＦＰｐＡＬＢ—ｓ！ｇＤＨ、ｅＡＦＰｐＡＬＢ— ＩｇＬ、ｅＡＦＰｐＡＬＢ－－ＧＦＰ ａｎｄ ｅＡｐｏＥｐＡＡＴ－－ｓＩｇＤＨ、ｅＡｐｏＥｐＡＡＴ－－ＩｇＬ ａｎｄ ｅＡｐｏＥｐＡＡＴ－－ＧＦＰ，ａｎｄ ｄｉｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ａｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｅｖｅ１．Ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｖｅｃｔｏｒｓ，ｗｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ． Ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｌＯＷ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓＩｇＤ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｓｐｌｅｅｎ ａｔ ＲＮＡ ｌｅｖｅ１．Ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗ—ｕｐ ＰＣＲ ａｎｄ Ｑ—ＰＣＲ ｆｏｒ ｖｉｓｃｅｒａ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓＩｇＤ ｃｏｕｌｄ ａｌｓｏ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｋｉｄｎｅｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＩｇＤ；ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ Ｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＨＩＤＳ）；ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ＩｇＤ基因是在进化上保守而古老的一种免疫球 蛋白重链基因类型ｌ＿】 ］。ＩｇＤ基因普遍存在于除鸟 型究竟是如何合成的详细机制目前还不清楚。最初 有研究认为ＩｇＤ只是作为Ｂ细胞表面的一个辅助 类之外的有颌类脊椎动物中，而其具体的功能还不 清晰。Ｂ细胞通过选择性拼接和类别转化重组 （ＣＳＲ）两种方法产生结构不同的ＩｇＤ＿】 ］。ＩｇＤ有 性抗原受体，传递与ＩｇＭ不同的信号，在免疫记忆 和免疫调节过程中起作用，从而放大抗体反应＿ｇ］。 随着研究手段的不断成熟，ＩｇＤ的其他功能也被不 断发掘。 跨膜型（ｍＩｇＤ）和分泌型（ｓＩｇＤ）两种类型，这两种类 收稿日期：２０１５—０３—１６ 作者简介：张希瑶（１９９１一），女，山西天镇人，在读硕士，研究方向：免疫遗传学 通讯作者：王喜凤，Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｂｗｃｗａｎｇｘｉｆｅｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ １５８ 青岛农业大学学报（自然科学版） 高ＩｇＤ综合征（ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ Ｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＨＩＤＳ），也称周期性发热综合征，也曾称 为变异型Ｓｔｉｌｌ病、还原尿睾酮热等口 。ＨＩＤＳ是以 血清中ＩｇＤ浓度升高、白细胞增多、血沉增快等为 生化特征和以周期性高热、腹痛、腹泻、关节炎、淋巴 结肿大等为生理特征的综合症。ＨＩＤＳ是可遗传 的，由于ｓＩｇＤ不能通过胎盘，无法通过母方血清直 接渗透而传递给子女ｌ１ ，所以推测ＨＩＤＳ是常染色 体的遗传性疾病。ＨＩＤＳ复杂而冗长的发病期给患 者带来了巨大痛苦，其具体的致病机制却一直没有 一个明确的阐述，但是关于这方面的研究也一直没 有停歇。现在主流的理论是甲羟戊酸激酶（ｍｅｖａｌ～ ｏｎａｔｅ ｋｉｎａｓｅ，ＭＶＫ）基因发生了错义突变，致使 ＭＶＫ活性降低，从而导致ＨＩＤＳ的发作 。还 有一种说法是ＨＩＤＳ的发作是由ＩｇＤ的产生引起 的。个体与不同抗原的接触，可能导致形成ＩｇＤ复 合体，从而诱导单核细胞分泌大量的炎症因子，包括 ＴＮＦ—ｄ、ＩＩ 一１８、ＩＩ 一１受体拈抗物、ＩＬ一６、ＩＬ一１０ 和血癌抑制因子¨］ 。 由于ＨＩＤＳ的致病机理并不明确，所以针对性 药物的研制也就举步维艰，目前也没有有效的市场 化的药物出现，而临床上也只是根据患者的不同症 状来给出治疗方案。本研究主要着眼于ＨＩＤＳ这一 疾病，对ＩｇＤ中ｓＩｇＤ的表达进行探索，由于ｓｌｇＤ在 血清中的含量极低且半衰期短，所以构建了肝脏特 异高表达ｓｌｇＤ的转基因小鼠模型。ＨＩＤＳ与ＩｇＤ 有着密不可分的关系，对于ＩｇＤ的详细研究可以对 此疾病的发病机理有更加深人的理解，可以推进相 关药物的研发与推广，进而提出针对性强的有效治 疗方案。本研究旨在为ｓＩｇＤ功能及受体的研究提 供良好的动物模型，进一步探讨ＨＩＤＳ发病机制。 １ 材料与方法 １．１表达载体的构建 １．１．１ 启动子和增强子的扩增 试验共构建了两种有不同启动子和增强子的载 体，分别为甲胎蛋白增强子（ＡＦＰ）和白蛋白启动子 （ＡＬＢ）、抗ｎ胰蛋白酶增强子（ＡＡＴ）和载脂蛋白Ｅ 启动子（ＡｐｏＥ），其中ＡＡＴ扩增于人的基因组，其 余三个都扩增于小鼠的基因组。 １．１．２ 目的序列的扩增 取小鼠的骨髓瘤细胞株Ｘ１６Ｃ，提取ＲＮＡ后反 转为ｃＤＮＡ，再以此ｃＤＮＡ为模板进行５’ＲＡＣＥ和 ３’ＲＡＣＥ来扩增重链（ｓＩｇＤＨ）。轻链（ＩｇＬ）的３’端 是由３’ＲＡＣＥ扩增的，但是５’端是仿照Ｓｏｍａ Ｒｏ— ｈａｔｇｉ提出的：小鼠的重排或表达的免疫球蛋白可变 区基因的特异性扩增方法ｌ１ ，利用ＩｇＬ的可变区 （Ｖ）中Ｖ２家族引物来进行扩增的，最终可扩增出的 ｓＩｇＤＨ的全长为１ １５２ ｂｐ，ＩｇＬ的全长为７０６ ｂｐ。 １．１．３ 荧光蛋白（ｅＧＦＰ）的扩增 ｅＧＦＰ扩增于载体ｐｃＤＮＡＴＭ６．２一ＧＷ／ＥｍＧ— ＦＰ—ｍｉＲ—ｎｅｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍｉｄ，该载体保存于实验 室，其上含有ｅＧＦＰ的基因片段，大小为７６４ ｂｐ。 １．１．４表达载体的获得 利用酶切与ＰＣＲ融合的方法获得将载体ｅＡＦ— ＰＤＡＬＢ—ｓＩｇＤＨ、ｅＡＦＰｐＡＬＢ—ＩｇＬ、ｅＡＦＰｐＡＬＢ— ＧＦＰ以及ｅＡｐｏＥｐＡＡＴ—ｓＩｇＤＨ、ｅＡｐｏＥｐＡＡＴ— ＩｇＩ 、ｅＡｐｏＥｐＡＡＴ－－ＧＦＰ。 １．２细胞水平的验证 构建转基因小鼠之前，先进行了在细胞水平上 的验证，先将质粒以脂质体法转染入细胞中，以验证 其转染效率。选取了小鼠肝癌细胞ＨｅｐＡ１—６细 胞，ＨｅｐＡ１—６细胞为贴壁细胞。 试验前，需要先优化细胞的转染条件。转染试 验在２４孔板中进行，通过Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｐｏ ２０００）将ＧＦＰ表达质粒瞬时转染入ＨｅｐＡ１—６细 胞，转染质粒量包括１００ ｎｇ，２００ ｎｇ，５００ ｎｇ，８００ ｎｇ，１ ０００ ｎｇ共５组，每组包括３个重复，同时设不 转染对照组（ｂｌａｎｋ）。试验进行４８ ｈ后观察ＧＦＰ 表达阳性细胞的比率，当ＤＮＡ质粒和脂质体使用 量增加时，细胞ＧＦＰ阳性率增加，但是同时也使细 胞的死亡数增加。对细胞进行ＧＦＰ阳性率计算，计 数方法为挑选４个视野进行细胞ＧＦＰ阳性率的统 计，之后取平均数，计算平均的转染效率。最终确定 ８００ ｎｇ质粒／２ Ｉ 脂质体为ＨｅｐＡ１—６细胞２４孔 板转染时的最优转染剂量，转染效率为８Ｏ ９／６以上。 将质粒ｅＡＦＰｐＡＬＢ—ＧＦＰ（简称为ＡＡ—ＧＦＰ） 和ｅＡｐｏＥｐＡＡＴ－－ＧＦＰ（简称为ＡＡＴ—ＧＦＰ）利用 脂质体法转入ＨｅｐＡ１—６细胞中，质粒量为８００ ｎｇ 质粒／２“Ｌ，同时设置阳性对照ｃＭＶ—ＧＦＰ，具体的 操作如前叙述，结果如图ｌ所示，图１中第一行为白 光下的细胞，第二行为蓝色激光下的细胞。结果说 明我们转入的载体有良好的表达效果。 １．３转基因小鼠的获得 将构建好的表达载体酶切线性化后进行显微注 射，将用ｅＡＦＰｐＡＬＢ—ｓＩｇＤＨ（简写为ＡＡ—ＩｇＤＨ） 载体和ｅＡＦＰｐＡＬＢ—ＩｇＬ（简写为ＡＡ一１ｇＬ）载体分 别用Ｂｇｌ ＩＩ和Ｎａｅ Ｉ双酶切，再进行琼脂糖凝胶电 ３期 张希瑶，等：肝脏特异性ＩｇＤ高表达转基因小鼠的构建 １６１ 合，还可以与其他免疫球蛋白的重链相结合，所以脾 脏中轻链表达并不能代表ＩｇＤ的表达［２７－３０］。接着 我们又检测了转基因阳性小鼠和阴性小鼠不同器官 中ＲＮＡ水平上ＩｇＤ的重链与轻链的表达情况，Ｑ— ＰＣＲ检测说明了小鼠的肾脏中的ＩｇＤ表达水平高 于其他器官的。 转基因动物模型技术在１９８０年首次成功后，经 历了多年的不断发展和完善，但是还是不能保证外 源基因可以完全高效稳定地整合到宿主的染色体 中，并且整合的随机性也无法有效解决。许多试验 结果表明，转入到动物体内的外源基因的表达受到 的影响因素远比体外细胞的多，而且制备过程及筛 选方法也比体外细胞复杂得多，所以外源基因是否 能够稳定表达也受到许多因素限制＿参口 ］ ］ ］ ３ 船］。 ］ 很多构建的转基因模型不能高效表达目的基因 或者根本不表达目的基因，也就是转基因活性低或 者无表达特异性，目前普遍的观点是由于染色体的 位置效应造成的 ３３］。位置效应指的是外源基因 整合位点周围的宿主基因组改变了它的作用模式， 使其发生异位或无法检测得到，从而也就无法正常 表达。甲基化作用是改变外源基因的一种方 式［２７，３４］，若外源基因整合到高度甲基化的染色体区 域，则可能会出现染色体结构、构象、稳定性及与蛋 白质相互作用方式的改变，进一步使外源基因转录 失活从而影响表达。除了甲基化作用以外，还有很 多可能使外源基因失活的原因，比如外源基因整合 到异染色质区或高度重复序列区，还有邻近基因的 增强子和沉默子也可导致外源基因的激活或失活， 但二者并无绝对的对应关系，大多数情况下沉默子 对外援积阴德影响更为强烈Ｌ３ ］。值得指出的是， 外源基因和宿主基因组序列之间的细微相互作用能 够使位于高表达的转基因周围的基因组促进另外一 个转基因的表达¨３ 引。 所以，我们此次的转基因小鼠没能在肝脏高效 的表达ＩｇＤ可能就是由于染色体的位置效应造成 的，现在研究表明有方法可以预防出现位置效应对 目的基因表达的干扰，但不可能完全避免。能够克 服位置效应提高目的基因表达的方法有：利用绝缘 子、利用大容量的载体如ＢＡＣ和ＹＡＣ、使用强启动 子或在多种组织中均表达的启动子、使用基因组或 者是含有一个到几个内含子的ｃＤＮＡ作为转基因 以及在载体中使用Ｋｏｚａｋ序列（ＧＣＣＡ／ＧＣＣＡＴ— ＧＣ）等等 。 ］ ］ ］ ］ ］ 口 Ｏ 口 １ １６２ 青岛农业大学学报（自然科学版） Ｓｐｅｃ Ｎｏ ２：Ｒ１３１—１３７ ３２卷 Ｄ ｗｉｔｈ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｆｅｖｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ＥＪ３．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，２００７， ５６（２）：６５８—６６１ －［２７］Ｃｈｅｎ Ｋ，Ｘｕ Ｗ，Ｗｉｌｓｏｎ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ，ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａ— ［－１６］Ｒａｍａｎａｎ Ａ Ｖ。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｒ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ 一一ｗｈａｔ ｓ ｉｎ ａ ｎａｍｅ ＥＪ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２００３， ３０（Ｉ２）：２５１３—２５１６ ｔｏｒｙ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｉｎ ｂａｓｏｐｈｉｌｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，１０（８）：８８９—８９８ ［１７］Ｈｏｕｔｅｎ Ｓ Ｍ，ｖａｎ Ｗｏｅｒｄｅｎ Ｃ Ｓ，Ｗｉｊｂｕｒｇ Ｆ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｃａｒｒｉｅｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｖ３７７Ｉ（１ １２９Ｇ＞Ａ）ＭＶＫ ｍｕｔａｔｉｏｎ，ａｓｓｏｃｉａｔ ｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｙｐｅｒ—ＩｇＤ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｆｅｖｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅｔｈ— ［２８］Ｓｗｅｎｓｏｎ Ｃ Ｄ，Ｔｈｏｒｂｅｃｋｅ Ｇ Ｊ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｇｉｎｇ ｏｎ ＩｇＤ ｒｅ— ｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ，１９９７．１６０：１４５—１５７ ｅｒｌａｎｄｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，２００３，１１（２）：１９６—２００ ［１８］Ｆｒｅｎｋｅｌ Ｊ，Ｒｉｊｋｅｒｓ Ｇ Ｔ，Ｍａｎｄｅｙ Ｓ Ｈ．Ｌａｃｋ ｏｆ ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ｐｒｏｄ— ［２９］Ｓｗｅｎｓｏｎ Ｃ Ｄ，Ｐａｔｅｌ Ｔ，Ｐａｒｅｋｈ Ｒ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ＩｇＤ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ Ｏ——ｇｌｙｃａｎｓ ｏｎ ｂｏｔｈ ｈｕｍａｎ ＩｇＤ ａｎｄ ＩｇＡ１ ｎｅｔｓ ｒａｉｓｅｓ ｅｘ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ——１ ｂｅｔａ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｈｙｐｅｒｉｍｍｕ— ｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ Ｄ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｆｅｖｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ＥＪ］．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，２００２，４６（１０）：２７９４—２８０３ ［１ ９］Ｓｏｍａ Ｒｏｈａｔｇｉ，Ｐａｒｕｌ Ｇａｎｊｕ，Ｄｅｖｉｎｄｅｒ Ｓｅｈｇａ１．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｄｅ— ｓｉｇｎ ａｎｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｎｅｓｔｅｄ（ＲＴ一）ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍ— ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ／ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒ ｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｓｍａｌｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８，３３９：２０５—２１９ ［２ｏ］Ｚｈａｎｇ Ｄ Ｅ，Ｇｅ Ｘ，Ｒａｂｅｋ Ｊ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓ—ａｃｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏ＇ｄｓｅ ａｌｐｈａ—ｆｅｔｏｐｒｏ— ｔｅｉｎ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｙ ｓｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｉ－Ｊ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，２６６（３１）：２１１７９—２１１８５ Ｌ２１］Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｇ，Ｓｕｂｂｏｔｉｎ Ｖ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ［Ｊ］．Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００１，３（３）：２８０—２９１ ［２２３ Ｗｏｏｄｄｅｌｌ Ｃ Ｉ，Ｒｅｐｐｅｎ Ｔ，Ｗｏｌｆｆ Ｊ Ａ．ｅｔ ａ１．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｌｉｖｅｒ—— ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｌｂｕｍｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ［Ｊ３．Ｊｏｕｒ— ｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，１０（５）：５５１—５６３ －［２３］Ｉｚｂａｎ Ｍ Ｇ，Ｐａｐａｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ０ｕ Ｊ．Ｃｅｌｌ—Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｃｅｌ１一Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ Ｅｌ— ｅｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｘｉｍａｌ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ Ｃｉｓ——Ａｃｔｉｎｇ ＤＮＡ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ一１６０［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９，２６４（１６）：９１７１—９１７９ －［２４３ Ｐｉｎｋｅｒｔ Ｃ Ａ，Ｏｒｎｉｔｚ Ｄ Ｍ，Ｂｒｉｎｓｔｅｒ Ｒ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ａｎ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｌｏｃａｔｅｄ １０——Ｋｂ Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ Ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ Ｉｔｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｔｏ Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，Ｌｉｖｅｒ—Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９８７，１（３）：２６８ ２７６ ［２５３ Ｈｕ Ｊ Ｍ，Ｃａｍｐｅｒ Ｓ Ａ，Ｔｉｌｇｈｍａｎ Ｓ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙ ｓｅｓ ｏｆ ａｌｂｕｍｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ＆ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，３（９）：５７７—５８８ ［２６］Ｗｈｉｔｅｌａｗ Ｎ Ｃ，Ｗｈｉｔｅｌａｗ Ｅ．Ｈｏｗ ｌｉｆｅｔｉｍｅｓ ｓｈａｐｅ ｅｐｉｇｅｎｏｔｙｐｅ ｗｉｔｈｉｎ ａｎｄ ａｃｒｏｓｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，２００６，１５ ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８，２８（８）：２３６６—２３７２ －［３０］Ｗｕ Ｙ，Ｌａｋｓｈｍｉ Ｔａｒｏｍａ Ｓ Ｍ，Ｌｉｍａ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ａｎｔｉ— ｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＩｇＤ ｗｈｅｎ ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓ ＩｇＤ—ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９，ｌ９２ （２）：１９４ ２０２ ［３１］Ｋｒｕｍｌａｕｆ Ｒ，Ｈａｍｍｅｒ Ｒ Ｅ，Ｔｉｌｇｈｍａｎ Ｓ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐ— ｍｅｎｔａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ——ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ Ｉ－Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８５，５（７）：１６３９— １６４８ ［３２３ Ｃｌａｒｋ Ａ Ｊ，Ｃｏｗｐｅｒ Ａ，Ｗａｌｌａｃｅ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｓｃｕｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｃｏ—ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｉ－ｊ］．Ｂｉ０／ｔｅｃｈｎ０ｌ０ｇｙ，１９９２，１０ （１１）：１４５０—１４５４ －［３３］Ｔａｎｇ Ｂ，Ｙｕ Ｓ，Ｚｈｅｎｇ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｇｈ——ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ——ＣＤ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ— ｂｏｄｙ ｉｎ ｍｉｌｋ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００８，１７（４）：７２７ ７３２ ［３４］Ｅｎｊｕａｎｅｓ Ｉ ，Ｓｏｌａ Ｉ，Ｃａｓｔｉｌｌａ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｉｌｋ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８，７２（５）：３７６２—３７７２ －［３５］Ｂａｃｃｅｔｔｉ Ｂ，Ｓｐａｄａｆｏｒａ Ｃ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｏｒｋｓｈｏｐ’’ｓｐｅｒｍ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｓｐｅｒｍ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．”［Ｍ］．Ｓｉｅｎａ，Ｉｔａｌｙ Ｍａｙ ２３—２６，１９９９．Ｍｏｌｅｃｕ— ｌａｒ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，５６（２Ｓｕｐｐ１）：２２７— ３３０ ［３６］Ｆｉｎｅ Ｊ Ｍ，Ｒｉｖａｔ Ｃ，Ｌａｍｂｉｎ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＩｇＤ．Ａ ｃｏｒｎ— ｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ６０ ｓｅｒａ ｗｉｔｈ ＩｇＤ“Ｍ”ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ［Ｊ３．Ｂｉｏ— ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｌ９７４，２ｌ（３）：ｌｌ９—１２５ －［３７３ Ｆｉｂｂｅ Ｗ Ｅ，Ｊａｎｓｅｎ Ｊ．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ＩｇＤ ｍｙｅｌｏｍａ：ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ２１ ｃａｓｅｓ［Ｊ］．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ。１９８４，３３（５）：４７１— ４７５ Ｅ３８］Ｌｉｇｔｈａｒｔ Ｇ Ｊ，Ｓｃｈｕｉｔ Ｈ Ｒ，Ｈｉｊｍａｎｓ Ｗ．Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｇｅｉｎｇ：ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｌｌ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐａｒｔ— ｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｔ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｌ９８５，５５（１）：１５—２１ ［３９］孙世惠，林艳丽，邓继先．提高转基因表达水平的策略［Ｊ］．生物 技术通讯，２００５，２（１６）：１９７—２００